非寄主抗病抑制子AvrRxo1的双功能结构域鉴定

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由革兰氏阴性黄单胞杆菌水稻致病变种Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)引起的水稻白叶枯病和X. oryzae pv. oryzicola (Xoc)引起的水稻细菌性条斑病(简称水稻条斑病)是目前水稻生产上最主要的两种细菌性病害。尽管水稻白叶枯菌和条斑病菌在基因组DNA水平上的同源性达到90%以上,但是两者的侵染方式有显著差异。水稻白叶枯菌是在植物维管束中繁殖增生,而条斑菌则是以植物叶肉细胞间隙繁殖并致病。目前在水稻体内已经鉴定了30多个白叶枯菌的主效抗病基因,但迄今为止尚未鉴定抗水稻条斑病菌的主效基因。Zhao等(2004)仅在非寄主玉米B73上克隆获得Rxo1基因,能与条斑病菌的特性保守基因avrRxo1相互识别并激发抗性反应,Rxo1在后期抗病水稻品种的培育中也得到了很好的利用。尽管如此,条斑病菌的抗性资源仍然十分有限。Makino等(2006)的研究证实水稻条斑病菌能抑制病原无毒蛋白AvrXa10与抗病蛋白Xa10的识别互作,说明在病原菌中可能存在某些效应因子来抑制寄主的抗性反应。本研究通过建立白叶枯菌PXO99a和本生烟的互作模式体系来筛选条斑病菌RS105的基因组文库,发现携带有avrRxo1基因片段的克隆能抑制PXO99a在烟草上的HR反应。继而从不同菌株中分离获得了五个avrRxo1等位基因,经序列比对分析,发现这五个等位基因在核苷酸水平上存在8-11个不等的碱基差异,进而造成氨基酸水平上的多态性。实验证明不同avrRxo1的等位基因产物均能抑制白叶枯菌PXO99a在烟草上产生的HR反应,也能被抗病蛋白Rxo1所识别。通过系列蛋白截短实验明确:效应子AvrRxo1羧基端的完整性对两种功能非常重要,即使去除1个氨基酸便影响其非寄主抗病的抑制能力,去除3个氨基酸就影响其被Rxo1的识别;氨基端的任意截短对两种功能都有影响;另外,编码预测的ATPase活性位点和核定位位点对拥有两种功能也是必需的。将携带羧基端和氨基端不同截短的功能肽段以及蛋白重要位点突变的AvrRxo1转化菌株PXO99a接种携带不同抗白叶枯病基因的水稻材料,出乎意料地发现完整AvrRxo1并不能抑制水稻对白叶枯菌的抗性,侵染病斑长度反而缩短;与野生型菌株相比,含有完整AvrRxo1的PXO99a转化菌株在抗感病水稻材料上细菌生长量均明显减少。巧合的是,所有水稻品种的接种结果显示,抑制PXO99a致病性的功能域与其识别Rxo1的关键功能域保持一致,暗示AvrRxo1可能会激发水稻的抗病反应,属于共进化上被打败的病原效应分子。另一直接的证据进一步通过avrRxo1的水稻转基因株系来证明:超量表达avrRxo1基因的阳性株系能够显著提高对水稻条斑病菌RS105和白叶枯病菌PXO99a的抗性水平。与野生对照植株相比,RS105接种转基因阳性株系的病斑长度要减短0.5-0.7cm不等;接种PXO99a的病斑长度缩短3cm左右。此外,荧光定量PCR检测显示avrRxo1转基因水稻中抗病相关基因PR1a和PR10的本底表达水平显著升高,说明AvrRxo1可激发水稻中非Rxo1介导的抗性反应。综上所述,我们鉴定了条斑病菌效应因子AvrRxo1的新的功能并发现多个结构域能影响相关的功能,发现AvrRxo1可以抑制白叶枯菌PXO99a在本生烟上产生HR反应,但不能抑制寄主水稻对该菌的抗性,相反AvrRxo1可能会激发水稻对病原菌的抗性,这一系列的发现有望在水稻抗病遗传改良上获得应用。
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