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禽腺病毒分为Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群,其中Ⅰ群和Ⅲ群病毒可以感染鸡。1群禽腺病毒有12个血清型,又可分为A、B、C、D、E等5个基因型。近几年来,由Ⅰ群禽腺病毒中的血清4型禽腺病毒(FAdV-4)所引起的鸡心包积液综合征(hydropericardium syndrome,HPS)在我国发病率呈上升趋势,给家禽养殖业造成很大的损失。为了防控HPS在我国的流行,有些养鸡场开始使用FAdV-4全病毒油乳剂灭活疫苗,取得较好效果。但是,FAdV-4全病毒油乳剂灭活疫苗的生产需要采用鸡肝癌细胞系(LMH)培养病毒,不仅疫苗的生产成本较高,而且这种疫苗存在一定的致瘤风险。为了解决FAdV-4全病毒油乳剂灭活疫苗生产中的问题,本研究将FAdV-4的主要中和抗原——纤突蛋白2(Fiber2)分别在真核和原核系统中表达,并对表达产物的免疫效力进行了评价。1.血清4型禽腺病毒Fiber2蛋白的表达以FAdV-4 GX2013株为模板,设计针对Fiber2基因的引物,采用PCR扩增Fiber2基因并克隆到酵母表达载体pPICZαA,得到重组质粒pPICZαA-Fiber2。将该重组质粒导入毕赤酵母宿主菌GS115,以甲醇诱导酵母重组蛋白(Y-Fiber2)的表达。SDS-PAGE和质谱鉴定显示,Y-Fiber2蛋白呈分泌表达,大小约为60 KDa左右。采取硫酸铵沉淀法结合活性炭粉对表达产物进行初步纯化和色素与气味的吸附,再使用30 KDa超滤管进一步浓缩。Western blot结果显示,Y-Fiber2蛋白得到有效纯化与浓缩,含量可达到6.3 mg/mL。本研究还利用大肠杆菌表达系统进行了 Fiber2蛋白表达。首先构建重组表达质粒pET32a(+)-Fiber2,然后转化大肠杆菌菌株BL21(DE3),经IPTG诱导重组Fiber2蛋白(E-Fiber2)的表达。SDS-PAGE鉴定结果显示,E-Fiber2蛋白呈可溶性,大小约为80 KDa左右。利用Ni-NTA亲和层析的方法对E-Fiber2蛋白进行纯化,纯化后的蛋白浓度为 1.67 mg/mL。2.血清4型禽腺病毒亚单位疫苗的研制分别将毕赤酵母和大肠杆菌表达的Fiber2蛋白(Y-Fiber2、E-Fiber2)与灭菌的Tween-80按95:5的比例混合成水相,再与灭菌后的油相1:1混合,充分乳化,制备成亚单位疫苗,并对其进行免疫效果的评价。将40只4日龄SPF雏鸡随机平均分为四组,分别为Y-Fiber2免疫组、E-Fiber2免疫组、FAdV-4全病毒油乳剂灭活疫苗免疫组和非免疫攻毒对照组。7日龄时,分别以颈部皮下注射方式接种Y-Fiber2亚单位疫苗和E-Fiber2亚单位疫苗,每只雏鸡接种10 μg重组蛋白;FAdV-4全病毒油乳剂灭活疫苗免疫组和非免疫攻毒对照组的每只雏鸡分别颈部皮下接种0.25 mL商品化疫苗和PBS。28日龄时,测得Y-Fiber2免疫组血清抗体的琼扩效价平均值为1:16(4Log2),E-Fiber2免疫组和FAdV-4全病毒油乳剂灭活疫苗免疫组血清抗体的琼扩效价平均值为1:32(5Log2)。28日龄时,每只试验鸡肌肉注射0.2 mL(105.5TCID50)的FAdV-4 GX2013毒株。攻毒后2d内对照组鸡只全部死亡,剖检发现HPS的典型病理变化;而各免疫组的鸡只表现正常,Y-Fiber2免疫组、E-Fiber2免疫组对强毒攻击的临床保护率均为100%。通过荧光定量PCR测定攻毒后第3 d和第7 d呼吸道、消化道的排毒量,E-Fiber2免疫组的排毒量低于Y-Fiber2免疫组和FAdV-4全病毒油乳剂灭活疫苗免疫组。因此,E-Fiber2和Y-Fiber2亚单位疫苗均具有良好的免疫保护效果,但E-Fiber2亚单位疫苗的效果更佳。