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地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)属玄参科多年生草本植物,是我国栽培历史最为悠久的药用植物之一。然而目前地黄生产却面临着现有品种退化、种质资源单一、新品种选育技术落后等问题,严重制约了地黄生产的可持续发展。本研究在已经构建大容量高质量的地黄转录组文库序列基础上,针对目前地黄基因组资源极其匮乏,难以进行基因组SSR标记开发的现状,运用EST-SSR分子标记技术进行地黄EST-SSR标记的开发、鉴定和多态性评价,主要研究内容如下：1.构建了地黄大容量转录组文库：利用Solexa测序技术分别在根中获得99,708条(R)转录组序列、叶中获得94,544条(L)转录组序列、根叶联合拼接获得94,479条(A11)地黄转录组序列。在此基础上,从公共数据库获取用454测序所构建地黄块根转录组文库和地黄所有用传统Sanger测序所获得EST序列,与本研究用Solexa测序构建的转录组文库进行跨平台联合优化组装,经过一系列的去冗余处理、低质量片段及其片段过短序列去除处理等,共获得87,665条转录本(Reh-Unigene),最长片段达8009bp、最短片段204bp、N50达到635bp。2.初步开发和鉴定了地黄EST-SSR序列：在构建的高通量转录组文库的基础上,通过严谨的生物信息学方法开发了1018个>18bp的EST-SSR位点,位点的长度统计表明：长度18bp的数量最多,长度最长的为74bp,随着长度增加SSR位点数量也相对降低。SSR的类型统计表明：二核苷酸数量最多共有721个,占据地黄总EST-SSR的70.8%,其次为三核苷酸和六核苷酸,分别有486和578个。在对地黄的EST-SSR进行类型统计,发现为AG/GT(457个)最多的重复类型,其次,AC/GT (256个), AAG/CCT (137个)其数量均在100以上：AAAAT/ATTTT最少(12个)。此外,大部分EST-SSR位点位于CDS区和UTR区。对已经鉴定和筛选的地黄EST-SSR位点(≥20bp),进行引物设计,在SSR位点侧翼有足够长度,并能成功设计引物的SSR位点有320条,基于转录组基础上的EST-SSR位点的开发为进一步进行地黄SSR位点多态性鉴定奠定基础。3.初步建立地黄最佳EST-SSR优化体系：通过优化DNA模板浓度、引物浓度、Taq酶浓度、dNTP浓度并结合正交优化实验首次构建并建立地黄EST-SSR的最佳扩增体系。优化的结果表明：DNA模板浓度最适范围为80～480ng、引物浓度的最适范围为0.1-0.9μmol.L-1、Taq酶浓度的最适范围为0.5～1.5U、dNTP最适浓度范围为100～200μmol·L-1通过不同PCR扩增因素的组合的正交优化,本研究筛选了最实用、方便、经济的地黄EST-SSR扩增体系,即：15μL的体系中含80ng模板DNA、0.13μmol·L-1引物,150μmol·L-1dNTPs和1.5U Taq DNA聚合酶,55℃进行30个循环。利用最优的PCR体系,对本研究设计选择的320对地黄EST-SSR引物进行可用性检验,结果表明：有180对可用稳定的在地黄温85-5品种扩增出预期条带,这表明本研究所鉴定和开发的地黄EST-SSR是可靠的。4.初步开发并建立了地黄多态性EST-SSR标记库并初步对地黄栽培种质资源和野生资源进行亲缘关系分类：选择本研究搜集的36份地黄种质资源中的12份,对180对已经鉴定引物进行多态性筛选,筛选的结果表明有80对EST-SSR具有较高多态性,多态性范围0.43～0.88,平均多态性0.56。从具有多态性的EST-SSR引物中随机选择5对,对本研究所搜集的36份地黄栽培或野生种质资源进行进行亲缘关系的初步评价和聚类,聚类的结果表明：36份种质资源可以显著的分为3类,一类是野生种质,二类是近缘野生种质,三类是栽培种质,亲缘关系的显著分群从侧面反映出本所鉴定的筛选的多态性EST-SSR引物是可靠的。经过本研究所筛选的多态性EST-SSR将为更多的地黄种质资源的亲缘关系鉴定和类群划分提供重要的分子依据,为地黄选育较高杂种优势的新品种提供重要的分子辅助育种手段。