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单增李斯特菌是一种严重威胁人类健康的食源性致病菌,WHO食品安全工作计划已将其列入重点监测对象。该菌可耐受高盐和较宽的pH,并且4℃条件下仍可生长和繁殖,使其在食品加工和储存过程中难以控制。因此,建立灵敏快速的单增李斯特菌检测方法对于及时控制该菌的污染和扩散具有重要意义。免疫磁分离技术是食源性致病菌快速富集的有效手段,传统的免疫磁分离方法中免疫磁珠用量较大,使得磁分离成本较高。本研究为了降低免疫磁分离的成本,建立了基于生物素放大暴露的磁富集分离方法,并联合PMA-PCR技术和核酸层析试纸条或流式细胞术实现了生菜中单增李斯特菌活菌的检测。各章内容分述如下:第一章综述了磁性纳米粒子在食源性致病菌检测中应用的研究进展。第二章建立了基于生物素暴露及放大的磁富集分离方法。研究中首先将生物素化抗体与单增李斯特菌孵育,从而使菌体表面暴露出生物素,随后加入链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子与菌体表面暴露出的生物素结合,并在磁场下完成单增李斯特菌的富集分离。相对于传统的基于免疫磁珠的分离方法,生物素暴露的磁富集分离方法抗体用量降低了10倍;在最佳的磁分离条件下,当PBS或生菜样本中单增李斯特菌浓度低于104 CFU/mL时的富集分离效率高于91.8%±1.3%。在基于聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状分子介导的生物素放大的磁富集分离方法中,生物素放大进一步降低了抗体用量,缩短了链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子靶向单增李斯特菌的时间,同时降低了磁性纳米粒子的用量。相对于传统的基于免疫磁珠的分离方法,PAMAM介导的生物素放大的磁富集分离方法抗体用量降低了20倍;链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子的用量降低了40%;单增李斯特菌的富集时间缩短了50%。在最佳的磁分离条件下,当PBS或生菜样品中单增李斯特菌浓度低于104 CFU/mL时的富集分离效率均高于89.15%±1.75%。第三章建立了基于PMA-PCR的单增李斯特菌活菌检测方法,联合核酸层析试纸条或流式细胞术实现了生菜样本中单增李斯特菌活菌的检测。PMA的用量为10μg/m L,卤素灯下处理5 min能有效抑制单增李斯特菌死菌DNA的扩增,而对单增李斯特菌活菌的DNA扩增无影响。基于PAMAM介导的生物素放大的磁分离方法,联合PMA-aPCR和核酸层析试纸条的检测方法对生菜样品中单增李斯特菌活菌的检测限为3.5×104 CFU/g;联合PMA-PCR和流式细胞仪的检测方法对生菜样品中单增李斯特活菌的检出限达到3.5×10~2 CFU/g。