论文部分内容阅读
目的:幽门螺杆菌(H.pylori)的全球感染率超过了50%,它是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病因,与肠型胃癌和胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤的发生密切相关。现有的根除H.pylori的手段主要是联合应用抗生素,但由于该菌感染的普遍性、耐药菌株的不断增加、较高的花费以及病人的低依从性等,限制了抗菌药物的疗效。因此,接种简便、成本低廉并易于大面积推广的H.pylori疫苗的研究十分迫切。在疫苗研究中,筛选有效的免疫抗原是关键性的环节。目前大多数疫苗采用的是与Hp致病相关的毒力因子作为抗原成分,如尿素酶(urease)、热休克蛋白(heat shockprotein,Hsp)、空泡毒素(vacuolating cytotoxin,VacA)、细胞毒素相关抗原(cytotoxinassociate antigen,CagA)、中性粒细胞激活蛋白(neutrophil-activating protein,NAP)等。革兰氏阴性细菌外膜蛋白具有良好的抗原活性,这些外膜蛋白作为抗体和免疫细胞攻击的主要靶标,可以介导对细菌最直接有效的杀灭作用,是决定免疫反应是否对人体具有保护性的关键因素。OMP18和UerB都是Hp的外膜蛋白成分,其编码基因具有高度保守性,也是Hp疫苗重要的免疫抗原。但一直令学者们遗憾的是每种抗原单独免疫动物时,获得的保护率均不是很高,而多种抗原联合免疫才能达到较好的效果。因此,本研究拟对上述二种保护性抗原基因进行克隆表达,并与分子内佐剂LTB串联得到多亚单位的融合蛋白,分别观察在小鼠体内诱导的不同免疫应答和保护作用,为筛选有效的H.pylori疫苗抗原奠定基础。方法:1、采用PCR方法从H.pylori临床分离株9806基因组中扩增OMP18基因片段并构建在原核表达载体pQE-30中,通过酶切、测序鉴定阳性重组子。应用生物信息学软件DNAssist和GenBank数据库对已公布的H.pylori OMP18基因序列进行相似性分析。将含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌M15中,经IPTG诱导表达,用AKTA-explore纯化仪纯化表达的重组蛋白rOMP18。应用Tris-Tricine方法对表达产物和纯化产物进行分析,用纯化的rOMP18免疫家兔,并采用Western blot和免疫扩散试验鉴定重组蛋白的免疫性。2、采用重叠延伸PCR的方法,分别以UreB414活性片段做为融合蛋白前端,与OMP18及粘膜佐剂LTB依次串联,和以粘膜佐剂LTB做为融合蛋白前端与OMP18依次串联,在片段间引入5个氨基酸的linker PQDPP进行连接;将融合基因构建在原核表达载体pET-28a中,经酶切及测序鉴定后,阳性重组子转化宿主菌E.coliBL21(DE3),IPTG诱导重组工程菌表达。Tris-Tricine电泳和免疫印迹鉴定融合蛋白,DNAssist软件分析融合蛋白理化特性,通过纯化条件摸索,AKTA-explore纯化仪纯化融合蛋白LTB-OMP18(LO)和UreB414-OMP18-LTB(UOL)。纯化后的融合蛋白分别与GM1神经节苷脂进行结合试验。3、将144只小鼠随机分为6组:PBS对照组、单亚单位分子内佐剂融合蛋白组(UreB414-LTB)、双亚单位分子内佐剂融合蛋白组(UreB414-OMP18-LTB、)单一亚单位分子内佐剂融合蛋白组(LTB-OMP18)、体外物理混合组(rOMP18+UreB414-LTB)无分子内佐剂单一亚单位蛋白组(OMP18)。分别于0、7、14、28天口服免疫,剂量为150μg/只/次。术次免疫后10天,每组取12只小鼠剖杀取样,ELISA检测口服免疫后血清特异性IgG、IgA,粪便、肠道冲洗液sIgA水平。每组余下12只口服10~8 CFU Hp小鼠适应株,30天后,取小鼠胃部标本通过Hp培养及特异性PCR检测,确定Hp感染率,并计算口服免疫后各组攻毒保护率。结果:1、经酶切鉴定和基因测序结果显示,H.pylori OMP18基因被正确克隆到pQE-30中。OMP18基因的核苷酸序列长度为540bp,与GenBank中序列比较,同源性为99%,氨基酸序列的同源性为100%。重组工程菌IPTG诱导,经Tris-Tricine分析,表达的目的蛋白分子量约为20KD,其表达产物占菌体蛋白的20%,为包涵体形式表达,经AKTA-explore 100蛋白纯化系统纯化,纯化后得到纯度＞85%的目的蛋白。以纯化蛋白为抗原加弗氏佐剂免疫家兔,制备兔抗rOMP18特异抗体,经免疫双扩散法检测,兔抗血清抗体效价为1:32,Western Blot结果也显示重组蛋白能被兔抗H.pylori血清所识别。2、经酶切鉴定和基因测序结果显示,成功构建了融合基因LTB-OMP18和UreB414-OMP18-LTB,将融合基因LO和UOL克隆到pET28a载体上,得到融合蛋白表达载体pLO和pUOL,DnaStra软件评价蛋白linker具有较好的柔韧性。将两个阳性重组子转化至E.coli BL21(DE3)后,37℃培养经IPTG诱导,表达的融合蛋白经SDS-PAGE和免疫印迹分析显示分子量约为31KD和43KD。UVP扫描证实融合蛋白表达约占总蛋白的25%和20%。包涵体鉴定试验证实融合蛋白主要以包涵体形式表达,确定了采用亲和层析的纯化方法。纯化后得到纯度＞85%的融合蛋白。纯化后的两个融合蛋白分别能与GM1神经节苷脂发生结合反应,实验证实重组融合蛋白中LTB组分具有与GM1神经节苷脂结合的生物活性,说明融合蛋白保持了LTB的天然活性,具有粘膜佐剂活性。3、ELISA检测融合蛋白rLO和rUOL免疫小鼠后血清特异性IgG、IgA,粪便、肠道冲洗液sIgA水平与PBS组相比,升高明显,差异极显著(p＜0.001),与亚单位免疫组相比,差异显著(p＜0.05),与多亚单位蛋白物理混合组相比,差异不显著(p＞0.05)。免疫攻毒后,免疫保护率为:rLO组67%(8/12),rUOL组83%(10/12)。统计分析显示,多亚单位融合蛋白组免疫保护率与PBS组相比,差异极显著(p＜0.001),与rOMP18组相比,差异显著(p＜0.05),与rOMP18+UreB414-LTB组相比,差异不显差(p＞0.05)。结论:1、成功克隆了H.pylori OMP18基因,与GenBank已公布的H.pylori菌株基因序列具有高度同源性。纯化的重组蛋白rOMP18,具有良好的免疫原性和免疫反应性,可以作为H.pylori基因工程疫苗候选抗原。2、成功构建、表达融合蛋白rLO和rUOL,纯化后的融合蛋白保持各亚单位组分及佐剂的独立免疫反应性,融合基因间的Linker对融合蛋白的立体构象影响较小。3、小鼠体内特异性抗体水平及免疫保护效果都证明融合蛋白rLO和rUOL具有良好的安全性和免疫保护效果。