论文部分内容阅读
目的表皮生长因子受体（EGFR）,作为受体酪氨酸激酶（RTKs）家族成员之一,在调节细胞代谢、生长和分化中发挥重要作用。同时它的过表达和异常激活也与多种癌症,包括非小细胞肺癌的发生发展密切相关。本研究以EGFR为靶点,利用可程序化的核酸自组装构建双链DNA桥来调控EGFR二聚化,探索EGFR的空间距离与EGFR二聚化激活的关系;在此基础上,利用所构建的一定长度的双链DNA桥来进一步抑制EGFR二聚化和下游信号通路激活以及细胞行为,从而为相关癌症的靶向干预与治疗提供新的思路和技术。方法1.可程序化的核酸自组装双链DNA桥的构建基于EGFR适配体设计适配体探针系列A、B和互补链C,通过碱基互补配对原则自组装形成七种不同长度（0 bp、10 bp、20 bp、30 bp、50 bp、70 bp和100 bp）的双链DNA桥,分别定义为双链DNA桥1、双链DNA桥2、双链DNA桥3、双链DNA桥4、双链DNA桥5、双链DNA桥6和双链DNA桥7。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光光谱表征双链DNA桥在溶液中的组装;并进一步通过流式细胞术和激光共聚焦成像来验证双链DNA桥在A549细胞膜上的构建。2.核酸自组装双链DNA桥用于细胞膜上EGFR二聚化调控的研究分别用七种不同长度的双链DNA桥与A549细胞孵育,通过Western Blot检测EGFR、p-EGFR、p-Akt和p-Erk1/2表达,探究不同长度双链DNA桥调控EGFR二聚化及下游信号通路激活的效果;在此基础上,以西妥昔单抗作为阳性对照组,选用双链DNA桥7（A7/B7/C7,100 bp）研究其不同浓度对EGFR、pEGFR表达的抑制效果。之后选择BEAS-2B细胞作为阴性对照细胞,通过EGFR、p-EGFR表达量验证双链DNA桥7的选择抑制效果。3.双链DNA桥7对A549细胞行为影响的研究首先,将不同浓度双链DNA桥7与A549细胞孵育,用Cell Counting Kit-8（CCK-8）检测细胞的生长增殖状况,计算双链DNA桥7对细胞的增殖抑制率。其次,选择合适浓度的双链DNA桥7,通过细胞划痕实验检测不同观察时间点双链DNA桥7对A549细胞迁移能力的影响,计算细胞迁移率。之后,利用Transwell侵袭实验检测双链DNA桥7对A549细胞侵袭能力的影响,通过计算穿过基质胶以及Transwell小室的细胞数量来获得相应的细胞侵袭率。结果1.可程序化的核酸自组装双链DNA桥构建的相关表征双链DNA桥1（A1/B1/C1,0 bp）的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示探针A1、B1与互补链C1混合的泳道只有一条条带,且亮度最强、位置比其余泳道条带滞后,表明单链A1、B1和C1杂交形成了双链DNA桥1;类似地,电泳结果显示双链DNA桥2～双链DNA桥7已成功制备。荧光光谱结果显示双链DNA桥上标记的Alexa488和Cy5,Cy3和Cy7发生荧光共振能量转移（FRET）,表明其在溶液中成功组装。流式细胞分析结果显示荧光标记的适配体探针A7-Cy5、B7-Alexa488与A549细胞孵育后,细胞荧光强度显著增强,表明适配体探针可有效识别并结合细胞膜表面EGFR。激光共聚焦成像结果可观察到A549细胞表面由于FRET而产生的荧光,从而验证了双链DNA桥在细胞膜上的成功构建。2.核酸自组装双链DNA桥调控细胞膜上EGFR二聚化的效果七种不同长度的双链DNA桥与A549细胞孵育后,Western Blot结果显示随着双链DNA桥的长度增加,p-EGFR、p-Akt和p-Erk1/2的表达量逐渐下降,而EGFR表达量未有明显变化,且双链DNA桥7对于上述三个磷酸化蛋白的抑制效果最明显（P＜0.05）。随着双链DNA桥7浓度增加,p-EGFR表达量逐渐降低（P＜0.05）;随着西妥昔单抗浓度增加,p-EGFR表达量亦逐渐降低（P＜0.05）,表明两者均可对p-EGFR表达产生有效的抑制。双链DNA桥7与BEAS-2B细胞孵育时,随着双链DNA桥7浓度增加,p-EGFR表达量与对照组相比没有明显变化,表明双链DNA桥7有较好的抑制选择性。3.双链DNA桥7对A549细胞行为的调控效果CCK-8结果显示,随着双链DNA桥7浓度的增加,A549细胞的增殖能力下降（P＜0.05）;分别利用50 nmol/L和100 nmol/L双链DNA桥7对细胞进行干预,细胞划痕实验表明细胞的迁移能力下降（P＜0.05）;Transwell实验结果显示在50 nmol/L和100 nmol/L双链DNA桥7处理24 h后,细胞的侵袭能力亦明显下降（P＜0.05）。结论可程序化的核酸自组装双链DNA桥可通过空间距离来调控EGFR二聚化,随着双链DNA桥长度的增加,其对EGFR二聚化的抑制效果逐渐增强。双链DNA桥7（100 bp）可有效抑制EGFR功能以及下游信号通路的激活,并可抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭行为,这为开发新型治疗药物提供了一条新的途径。