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花青苷是一种具有生物活性的黄酮类化合物,广泛存在于各种植物中,是大多数水果、蔬菜、鲜花和谷物的呈色物质,具有强抗氧化性。血橙(Citrus sinensis)富含花青苷,是一种重要的甜橙栽培品种。本研究比较分析了三个血橙品种的果实品质;探究了果实发育过程中花青苷含量变化;克隆果实汁胞细胞中一个MYB转录因子(CsMYB)全长表达序列,开展了生物信息学分析及基因表达模式研究;原核表达CsMYB重组蛋白,经动物免疫后制备多克隆抗体,使用Western blot技术检测不同样本之间的CsMYB差异表达;利用酵母双杂交技术,开展CsMYB与其他蛋白相互作用的研究。主要研究结果如下:(1)不同血橙品种之间的果实品质比较分析三个品种的果实内在品质存在显著差异。‘早红血橙’果汁中总花青苷与可溶性固形物含量最高;‘晚红血橙’果汁中可滴定酸含量最高;‘3号血橙’果汁中可溶性总糖含量最高。然而,三个品种的果实的单果重与果皮色度值等外在品质没有显著差异。随着‘早红血橙’果实的发育,其花青苷含量差异显著。幼果膨大期(花后131天),果汁中花青苷含量较低,仅有0.48 mg/L;转色成熟期(花后238天),花青苷含量为6.006 mg/L;留树保鲜期(花后302天),花青苷含量迅速上升至85.32 mg/L。(2)血橙CsMYB克隆与生物信息学分析果实汁胞细胞cDNA为模板,同源克隆获得了一个MYB型转录因子,全长表达序列为789 bp,编码262个氨基酸,具有R2与R3 MYB保守结构域,命名为CsMYB(Gen Bank No.KT757348)。CsMYB的N末端包含一段与bHLH转录因子相互作用的保守基序([DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R),C末端包含一段具有调控花青苷生物合成功能的保守基序(KPRPR[S/T][F/L])。不同植物来源的同源MYB系统进化树的聚类结果表明,血橙CsMYB与荔枝Lc MYB1聚在同一个进化支上,两者在氨基酸水平上同一性为56.1%。血橙叶片基因组DNA为模板,成功克隆了CsMYB基因组序列与其启动子序列。CsMYB基因组序列全长1681 bp,包含三个外显子和两个内含子。CsMYB启动子序列全长750 bp,包含5’端UTR和LTR。启动子序列中存在多个低温响应元件、光响应元件及逆境响应元件。(3)CsMYB表达模式研究三个血橙品种之间的CsMYB转录量存在显著差异。花青苷含量较高的‘早红血橙’中,CsMYB转录量最高。果汁花青苷含量与果肉组织中CsMYB、CsbHLH、CHS转录量的皮尔逊相关系数分别为0.805(p≤0.01)、0.762(p≤0.05)、0.772(p≤0.05)。不同组织之间相比较,果实汁胞细胞中CsMYB转录水平最高,CsbHLH也具有相同的表达模式,但Cs WD40在果肉、叶片、花、新梢等不同组织中都是高表达。随着果实的发育与成熟,果实汁胞细胞中CsMYB、CsbHLH的表达量逐渐上升,同时参与花青苷生物合成途径的查尔酮合成酶(Chalcone synthase,CHS)、花青素合成酶(Anthocyanidin synthase,ANS)、二氢黄酮醇-4-还原酶(Dihydroflavonol-4-reductase,DFR)和无色花色素双加氧酶(Leucoanthocyanidin dioxygenase,LDOX)与谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S-transferase,GST)的转录变化趋势与前两者一致。血橙果皮颜色突变嵌合体中,红皮中CsMYB、CsbHLH转录量高于黄皮,CHS、DFR与前两者表达模式一致。嵌合体红皮与黄皮对应果肉组织中具有相似的颜色(两者花青苷含量没有明显差异),两者果肉组织之间CsMYB、CsbHLH、DFR、CHS转录量没有显著差异。(4)CsMYB多克隆抗体制备与Western blot检测构建原核表达载体p ET28-CsMYB,将其转入Escherichia coli(E.coli)BL21,获得了原核表达工程菌株。提取CsMYB重组蛋白,动物免疫后获得多克隆抗体。使用纯化抗体对CsMYB重组蛋白进行Western bolt检测,在36 k D处有单一杂交条带。Western bolt实验结果表明,血橙果肉中特异性表达CsMYB。(5)MYB、bHLH、WD40转录因子相互作用研究酵母双杂交实验结果表明,血橙CsMYB蛋白与CsbHLH蛋白不能直接发生相互作用,而Cs WD40蛋白可以分别与CsMYB蛋白和CsbHLH蛋白发生相互作用。综上所述,CsMYB可能参与调控血橙果肉花青苷的生物合成,本研究为血橙果实着色机制研究与遗传育种提供参考依据。