目的：　　蛋白质组学目前在生命科学领域中拥有其特殊而重要的地位，关于各类蛋白与疾病的关系研究也成为了众多科研工作者研究的热点，其中，磷酸化蛋白在许多交叉学科中经常涉及，因此也产生了磷酸化蛋白质组学这一新型的蛋白质组学分支。研究的主要内容包括磷酸化蛋白质的分离与检测，磷酸化蛋白质与疾病因子的关系研究等等。其中关于蛋白质的分离与检测成为了后续研究的基础，在研究过程中则经常应用到聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白与钙羧酸荧光检测磷酸化蛋白。　　在聚丙烯酰胺凝胶上建立一种具有快速、灵敏、特异等特点的磷酸化蛋白检测方法，能够在短时间内灵敏、精确、特异地检测到磷酸化蛋白，同时可以兼容其他常规染色检测方法，并且与质谱也具有良好的兼容性，或通过与其他仪器技术的联用，能够帮助解决磷酸化蛋白质组学研究过程中的薄弱环节问题即缺少特异灵敏的特异性蛋白检测手段，从而帮助蛋白质组学研究过程中有关于蛋白质的定性、定量分析等问题的解决，起到促进磷酸化蛋白质组学的发展的作用的目的。　　方法：　　(1)聚丙烯酰胺凝胶是目前广泛应用的一种蛋白分离技术，可以根据蛋白质样品的不同分子量和等电点来有效分离混合样品中的不同蛋白，方便应用与后期的蛋白检测及其他蛋白质组学的研究，故而成为最可靠的一种蛋白分离技术。本课题中应用在聚丙烯酰胺凝胶上（1D和2D）分离目标标准品混合蛋白和实际样品，建立一种关于磷酸化蛋白质特异性检测的方法。　　(2)通过研究钙羧酸(CCA)荧光的特性，利用钙羧酸在不同化学微环境（多种有机试剂，不同pH环境）以及与不同类型蛋白质（磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白）作用下的荧光性质的不同，经过大量的筛选，以特异性为优先筛选条件，灵敏度为第二提高的目标，建立一种特异性的检测磷酸化蛋白的方法。　　(3)方法建立后，为了避免假阳性的出现，采取通过与Pro-Diamond(PD)试剂盒、Western Blot等现有实验技术的实验结果进行对比验证的方法，多重证明CCA磷酸化检测方法的特异性;通过质谱鉴定，对检测到的蛋白条带进行更深入的分析，更具说服力地验证CCA检测方法的特异性、准确性，并找到相应的磷酸化修饰位点。　　结果：　　1.成功建立了一种快速、特异、灵敏的以CCA荧光淬灭原理为基础的检测方法，详细步骤如下:　　(1)染色:将电泳之后的凝胶放置于50 mL含有50μM钙羧酸（母液溶解于水中），20％1，2-丙二醇，0.5％醋酸的染色液中染色25min;　　(2)脱色:将染色完毕的凝胶放置于50 mL含有80μM AL3+，10％甘油，100 mM醋酸钠脱色液中脱色20 min。　　(3)通过成像装置，在一定的激发波长条件下拍摄图像，储存。　　2.通过与PD试剂盒、Western Blot进行实验结果对比，去磷酸化实验进一步验证特异性并通过质谱检测磷酸化修饰位点等实验，最终证明了CCA方法具有特异性较好，检测限高，线性关系好，重现性好等优点。可以实际应用于磷酸化蛋白质组学中特异性的检测磷酸化蛋白。　　3.为了可以实现方法的产业化、市场化，我们将所建立的钙羧酸磷酸化蛋白检测方法放置于不同气候的不同实验场合，在不同外界条件下进行多次的重复实验，以保证方法的稳定性。　　结论：　　CCA检测法具有操作方便（仅2步）、检测限低（4-8ng，好于PD试剂盒）、特异性好（优于PD试剂）、实验时间短(45min)等优点，可以在短时间内特异性高灵敏的检测到磷酸化蛋白，这正好可以帮助解决磷酸化蛋白质组学中缺少好的磷酸化蛋白检测方法的这一问题，可为磷酸化蛋白质组学的发展提供帮助，是一种可靠的磷酸化蛋白检测方法。