目的 (1)分离培养大鼠 Kupffer 细胞(KCs),观察在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激下 KCs 的活化情况,以及 LPS 刺激前转 染 人 工 合 成 的 NF-κB 圈 套 寡 脱 氧 核 苷 酸 ( decoy oligodeoxyribonucleotide, decoy ODN)对 KCs 活化的抑制作用。(2)建立大鼠原位肝移植动物模型,总结手术技巧和方法,观察 Lewis(Lew)到 Brown Norway(BN)大鼠同种异体急性排斥反应(acute rejection, AR)的发生发展以及基本病理生理指标变化过程。(3)观察细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原 4-Ig(cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4-Ig,CTLA4-Ig)单独应用或与 NF-κB 圈套联合应用对大鼠急性排斥反应的抑制作用。通过以上三部分实验,试图阐明 NF-κB 圈套协同CTLA4-Ig 抗大鼠肝移植急性排斥反应的确切机制。 方 法 (1)胶原酶原位灌注法分离大鼠 KCs 并随机分为 3 组:正常对照组、LPS 刺激组及 NF-κB 圈套组,后者在 LPS 刺激前用脂质体将人工合成的 NF-κB 圈套(异硫氰酸荧光素标记)转染 KCs(4μg/1x105 KCs),并通过荧光显微镜鉴定转染效果。除对照组外,两个实验组培养液中加入终浓度为 1mg/L 的 LPS,于 LPS 刺激 6h 后,检测 KCs 吞噬功能改变(吞噬墨汁实验),免疫组化检测 NF-κB 细胞内易位情况,凝胶电迁移率改变分析法(EMSA)检测 NF-κB 蛋白结合活性,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测 KCs 膜表面 CD80 mRNA表达, ELISA 检测培养上清 TNF-α 和 IL-6 表达情况,确定 LPS 对 KCs的激活,以及 NF-κB 圈套对 KCs 活化的抑制作用。(2)用“两袖套法”建立大鼠原位肝移植动物模型,即肝上下腔静脉用缝合法连续吻合,门静脉、肝下下腔静脉用袖套法吻合,胆管内支架法完成胆道重建。实验分 3 组进行:正常对照组、同基因移植组(LEW-LEW)及同种异基因移植组(LEW-BN)。除观察大鼠存活率外,移植组受体分别于术后 3 d,5 d,7 d 和 10 d 活杀取标本,观察肝脏组织病理和超微结构变化,全自动生化分析法测定血清谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)和白蛋白(Alb)水平变化,ELISA 检测血清 IL-2 含量,阐明肝移植急性排斥的发生发展过程,以及基本病理生理指标变化特征。(3)按上述方法建立大鼠肝移植急排模型(LEW-BN),实验分 4 组进行:急排组(术后不给予任何免疫抑制剂处理)、CTLA4-Ig 组(移植术后当天至术后第 7 天,每天腹腔内注射 CTLA4-Ig 0.25mg/kg 体重)、NF-κB圈套组(移植术前 2 天供体经尾静脉注射 120μg 脂质体包裹的 NF-κB圈套)、联合用药组(供、受体同时接受圈套和 CTLA4-Ig 治疗,用药方法和剂量同前两组)。除观察大鼠存活率外,各组大鼠于术后第 7d活杀动物,取其肝脏分离 KCs,荧光显微镜检测圈套的转染效果,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测 NF-κB 转录活性,RT-PCR 观察 KCs膜表面共刺激分子 CD80、CD40、CD54 mRNA 表达,原位杂交检测移植肝中 TNF-α、IFN-γ mRNA 表达,末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测肝脏和脾脏细胞凋亡,同时观察肝脏组织病理、超微结构,及肝功变化。阐明 NF-κB 圈套协同 CTLA4-Ig抗大鼠肝移植急性排斥反应的分子机制。 结果 (1)脂质体可以介导 NF-κB 圈套高效转染 KCs,转染后48 h 荧光显微镜下鉴定转染效果达 85%;在 LPS 刺激下,培养的 KCs表现出活化特性: 吞噬墨汁功能明显增强,免疫组化显示 NF-κB 由胞浆易位进入胞核,EMSA 显示细胞核内 NF-κB 活性明显增强,RT-PCR