Cecropins是Boman等人首次从惜古比天蚕(Hyatophora cecropia)中提取出来的一类抗菌肽家族,目前已发现的cecropins达20多种。Cecropins家族具有形成特定两亲性α-螺旋的能力,因此它们可针对非极性脂质的细胞膜并在微摩尔浓度下对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有强烈的抗菌活性。已有文献证明cecropins可抑制多种肿瘤细胞系如白血病、肝癌、膀胱癌和胃癌等的增殖但不损伤正常细胞,这一特点使得cecropins有望成为新一代的抗肿瘤药物。本研究采用实验室前期从新疆家蚕Bombyx mori体内获得的抗菌肽基因,通过Saccharomyces cerevisiae真核表达获得新疆家蚕抗菌肽(CecropinXJ)。CecropinXJ是一种含有37个氨基酸的小分子阳离子抗菌肽,分子质量为3.9 kDa,等电点为10.37,所编码的氨基酸序列与已报道的cecropin B序列同源性达到98%,具有两亲性α-螺旋区域。实验研究表明,CecropinXJ可以抑制多种肿瘤细胞的增殖,并且能够促进肿瘤细胞的凋亡,然而其抗肿瘤机制尚不清楚。本研究采用MTT法检测CecropinXJ对3株人胃癌细胞及人胃粘膜上皮正常细胞增殖的影响,筛选出敏感株人胃癌BGC823细胞进行体内、外抗肿瘤活性及其相关机制研究。通过MTT和软琼脂集落形成实验观察CecropinXJ对BGC823细胞体外增殖和生长的影响,流式细胞仪检测BGC823细胞周期分布和细胞凋亡情况,透射电镜、倒置荧光显微镜观察细胞形态学变化;建立裸鼠BGC823荷实体瘤和Balb/c恶性腹水瘤模型,进行实验治疗学观察。采用肿瘤体积、瘤重、小鼠体重等指标,观察CecropinXJ对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制效应,通过病理组织学观察肿瘤组织和小鼠脏器的病理变化,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、western blot和免疫组织化学方法检测凋亡相关蛋白、PI3K/Akt信号通路相关蛋白和血管生成相关蛋白的表达变化,探讨CecropinXJ的抗肿瘤作用机理。主要研究结果如下:1、CecropinXJ体外能显著抑制人胃癌BGC823细胞的生长并通过激活线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。MTT和软琼脂集落形成实验表明CecropinXJ抑制BGC823细胞的增殖和降低其集落形成能力,具有时间和浓度依赖性,但对GES-1细胞无明显的抑制增殖作用。CecropinXJ可通过阻滞BGC823细胞周期在S期进而抑制细胞增殖。流式细胞仪和形态学观察显示CecropinXJ诱导BGC823细胞凋亡。进一步研究发现CecropinXJ可引起细胞内活性氧增加,线粒体膜电位下降。qRT-PCR和western blot结果表明CecropinXJ能够引起Bcl-2表达下调,Bax表达上调,促进细胞色素c的释放并活化caspase。CecropinXJ增加caspase-3/8/9活性呈剂量依赖,经caspase-3和caspase-9特异性抑制剂处理后可降低CecropinXJ介导的BGC823细胞死亡率。这些结果表明CecropinXJ体外能显著抑制人胃癌BGC823细胞的生长并通过激活线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。2、CecropinXJ单独和与LY294002联合使用通过作用PI3K/Akt通路抑制胃癌BGC823细胞的生长。CecropinXJ抑制Akt的磷酸化水平阻断PI3K/Akt信号通路,进而通过下调Bad磷酸化、升高下游促凋亡蛋白的表达和降低抗凋亡蛋白的表达抑制PI3K/Akt信号通路介导的细胞生长。与LY294002联用后,可增强CecropinXJ对PI3K/Akt信号通路的阻断作用,而且更能有效抑制BGC823细胞的体外生长并诱导其凋亡。3、建立人胃癌Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型,探讨CecropinXJ的体内抗肿瘤活性及其对肿瘤血管生成的影响。结果显示CecropinXJ对小鼠肿瘤体积的增长具有抑制作用。显微镜下可见CecropinXJ处理组肿瘤组织呈片状坏死,细胞间质变大。并且检测到CecropinXJ处理可引起肿瘤组织中的肿瘤细胞凋亡。除此之外,CecropinXJ能够抑制肿瘤组织和BGC823细胞中血管生成相关因子CD31、CD34、VEGF、bFGF和vWF的表达。这些结果表明CecropinXJ能够明显抑制人胃癌BGC823细胞裸鼠移植瘤的生长、促进肿瘤细胞凋亡和抑制血管生成。4、建立Balb/c荷瘤小鼠恶性腹水瘤模型,探讨CecropinXJ腹腔内注射对人胃癌恶性腹水瘤生长的抑制作用。结果显示与BSA对照组相比,CecropinXJ和阿霉素(Doxorubicin,Dox)均能抑制恶性腹水瘤的形成,缩小肿瘤在体内的扩散。CecropinXJ组和Dox组相比较,CecropinXJ能明显提高荷瘤小鼠腹水中BGC823细胞的凋亡率,改善荷瘤小鼠的生存质量。