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微生物油脂是指由微生物合成并储存在菌体内的甘油脂,其脂肪酸组成与一般的植物油脂相似。长期以来,微生物油脂主要用途为重要油脂(如可可脂)替代品、功能性油脂提供者、植物食用油脂补充以及生物柴油原料等。随着微生物油脂的用途扩展到能源化工领域,降低生产成本,满足产业化要求,已经成为一个急需解决的瓶颈问题。木质纤维素原料来源广泛、价格低廉、且能再生,被认为是微生物油脂生产的理想原料。通过水解,木质纤维素可转化为木质纤维素水解液作为油脂发酵底物。稀酸水解与酶水解相比在成本与效率上具有一定优势,是现今生物炼制产业化的首选。本课题组的授权专利技术,即微分式渗滤床稀酸水解技术,可以提供大量油脂发酵所需的木质纤维素稀酸水解液。
为了建立适合后续中试示范与产业化示范的基于木质纤维素稀酸水解液油脂发酵工艺,本论文对课题组5株油脂酵母(皮状丝孢酵母、粘红酵母、浅白隐球酵母、圆红冬孢酵母、解脂亚罗酵母)在玉米芯稀酸水解液中油脂发酵效果比较,发现皮状丝孢酵母能获得显著较高的油脂得率,因此选定其作为主要研究对象。在此基础上,利用皮状丝孢酵母在玉米芯稀酸水解液中发酵8天后,生物量、油脂含量、油脂得率、糖油脂得率分别为22.1g/L,35.9%,7.9g/L和17.4%;除此之外,皮状丝孢酵母还能利用象草稀酸水解液进行油脂发酵,但其油脂得率仅有5g/L左右,因此玉米芯稀酸水解液是更适合皮状丝孢酵母油脂发酵的底物。将皮状丝孢酵母在玉米芯稀酸水解液中的菌体生长动力学模型,产物合成动力学模型以及底物消耗动力学模型与模拟培养基中的动力学模型对比,发现,尽管在发酵初期,模拟培养基中菌种生长速率高于玉米芯稀酸水解液中的值,但皮状丝孢酵母在玉米芯稀酸水解液中能获得更高的油脂得率,进一步表明玉米芯稀酸水解液是皮状丝孢酵母油脂发酵的理想底物。动力学模型表明,基于木质纤维素稀酸水解液与模拟培养基油脂发酵的动力学规律有明显的不同;明显地,皮状丝孢酵母在玉米芯与象草稀酸水解液中油脂发酵的规律也不同,这可能是由于木质纤维素稀酸水解液中非糖化合物(抑制剂)所造成的。同时,尽管皮状丝孢酵母在玉米芯稀酸水解液中的糖油脂转化率可达17.4%,但仍未能满足产业化的要求(20%以上)。
为了提高皮状丝孢酵母在玉米芯稀酸水解液中的油脂得率与糖油脂转化率,我们系统研究了基于玉米芯稀酸水解液培养基组成与培养条件对皮状丝孢酵母细胞生长与油脂积累的影响。在模拟培养基中,皮状丝孢酵母油脂发酵最适的C/N比为100。令人意外的是,在玉米芯稀酸水解液中添加额外的氮源对皮状丝孢酵母的细胞生长与油脂积累会产生一定的抑制作用,这可能是因为玉米芯稀酸水解液中本身存在的氮源物质使其C/N比在100以上,因此,添加氮源反而会抑制油脂发酵。添加MgSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O以及KCl(其最适浓度分别为0.3、3.0×10-3、3.0×10-3和0.4g/L),能促进皮状丝孢酵母的细胞生长与油脂积累。接种量、发酵初始pH值以及培养温度也能显著影响皮状丝孢酵母的细胞生长与油脂积累,其最适值分别为5%、6.0和28℃。在最适条件下,皮状丝孢酵母在玉米芯稀酸水解液中的生物量(22.9g/L)略有提高(3.6%),而其油脂含量(45.4%)与糖油脂转化率(22.9)则有显著提高(26.5%和31.6%)。
在上述研究基础上,我们进一步研究了木质纤维素稀酸水解液中典型的抑制剂(有机酸、呋喃化合物、芳香族化合物等)对皮状丝孢酵母细胞生长与油脂积累的影响规律,以指导后续木质纤维素原料水解与其水解液脱毒工艺的改进。4种典型有机酸包括甲酸、乙酸、丁酸与乙酰丙酸对皮状丝孢酵母细胞生长与油脂积累的影响较小。在较大浓度范围内,这些有机酸还能促进皮状丝孢酵母的细胞生长与油脂积累。这4种有机酸在一定浓度范围内对皮状丝孢酵母的糖代谢也能有所促进。HPLC结果表明,上述有机酸可以作为皮状丝孢酵母的碳源用于油脂发酵,甲酸是皮状丝孢酵母的一种代谢副产物。呋喃类化合物中,糠醛对皮状丝孢酵母油脂发酵的毒性要大于5-羟基甲基糠醛;在低浓度下,糠醛与5-羟基甲基糠醛能促进皮状丝孢酵母的油脂积累。芳香族化合物中,阿魏酸与丁香醛在一定浓度范围内能促进皮状丝孢酵母的油脂积累;阿魏酸与丁香醛能提高皮状丝孢酵母油脂中不饱和脂肪酸的比例。
综上所述,本论文成功筛选到皮状丝孢酵母高效利用木质纤维素稀酸水解液发酵产油脂。与此同时,本论文还揭示了木质纤维素水解液中不同种类抑制剂对皮状丝孢酵母细胞生长与油脂积累的影响规律,为后续木质纤维素原料水解及其水解液脱毒提供了理论依据。