【摘 要】
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目的:胰脂肪酶是由胰腺产生后释放到胃肠体系,与肝脏产生的胆汁酸盐协同作用,将膳食脂肪分解为脂肪酸和甘油,负责约50%～70%的膳食脂肪的水解,是调控哺乳动物脂类物质吸收的关键酶。在以往的研究中,通常使用猪胰脂肪酶（p PL）作为酶源来筛选和表征PL抑制剂,从而产生多种p PL抑制剂。相比之下,对人胰脂肪酶（h PL）有效的抑制剂却鲜有报道。因此,本研究旨在以h PL为酶源,以近红外探针DDAO-o
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目的:胰脂肪酶是由胰腺产生后释放到胃肠体系,与肝脏产生的胆汁酸盐协同作用,将膳食脂肪分解为脂肪酸和甘油,负责约50%～70%的膳食脂肪的水解,是调控哺乳动物脂类物质吸收的关键酶。在以往的研究中,通常使用猪胰脂肪酶（p PL）作为酶源来筛选和表征PL抑制剂,从而产生多种p PL抑制剂。相比之下,对人胰脂肪酶（h PL）有效的抑制剂却鲜有报道。因此,本研究旨在以h PL为酶源,以近红外探针DDAO-ol为底物构建抑制剂高通量筛选与评价方法,通过对所收集的百余种中草药进行检测,发现天然强效的h PL抑制剂并研究其抑制机制,从而进一步阐释中草药的减肥和降血脂药效物质基础,为肥胖及相关代谢疾病的治疗提供候选药物。此外,本研究测定了64种天然和合成的黄酮类化合物对h PL的抑制作用,并讨论了黄酮类化合物作为h PL抑制剂的结构抑制关系,为药物化学家改进黄酮类衍生物作为h PL抑制剂提供有价值的研究基础。方法:（1）构建以特异性荧光探针DDAO-ol为底物的h PL抑制剂高通量筛选方法,对收集的百余种中草药和64种天然及合成的黄酮类化合物进行抑制活性测定;（2）采用LC-TOF-MS/MS进行指纹图谱采集来鉴定中草药中的活性化合物;（3）对新鉴定的强效抑制剂进行半数抑制浓度(IC50)和抑制常数（Ki）的测定并进行酶抑制动力学分析;（4）通过抑制剂分子与h PL蛋白晶体结构的对接模拟和分子动力学模拟,进一步验证抑制剂与h PL的相互作用位点和作用强度。结果:（1）以h PL特异性近红外探针DDAO-ol为底物,构建h PL抑制剂筛选评价体系。通过高通量筛选发现藤茶提取物（AGE）具有抗h PL的生物活性,利用一系列研究技术鉴定出有效的h PL抑制剂。研究结果表明,AGE中几乎所有的黄酮类化合物都是天然存在的h PL抑制剂,其中两种含量丰富的黄酮类化合物（二氢杨梅素和异二氢杨梅素）是中度的h PL抑制剂,而杨梅素和槲皮素被鉴定为强效的h PL抑制剂,IC50值约为1.5μM。抑制动力学分析表明,杨梅素和槲皮素以非竞争性的方式抑制h PL,其Ki值小于2.5μM。分子动力学模拟表明,杨梅素和槲皮素可以在变构位点紧密结合h PL。（2）通过研究64种黄酮类化合物对h PL的抑制活性,结果表明黄酮类化合物骨架上的酚羟基的数量和位置对h PL的抑制作用至关重要,C-5位形成的邻苯二酚或邻苯三酚基团能增强h PL抑制能力,而C-6,C-7位的羟基变成甲氧基化,则导致h PL抑制作用的丧失;其次B环上的C-4’引入羟基或者氨基促进了h PL抑制能力,而甲氧基化将降低对h PL的抑制作用;B环上C’-4位形成邻苯二酚会增加对h PL的抑制作用;最后C-2和C-3的形成不饱和的双键会增加对h PL的抑制作用。结论:在本研究中通过高通量筛选百余种中草药,发现AGE对h PL具有显著的抑制活性,再通过LC-TOF-MS/MS进行指纹图谱采集发现AGE中的多种黄酮类化合物是h PL的天然抑制剂。随后通过收集64种黄酮类化合物讨论了黄酮类化合物对h PL的结构抑制关系。这些发现为AGE的抗肥胖作用提供了直接证据,且这些新发现的h PL抑制剂可以作为开发新型药物的先导化合物。
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