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[目的]化疗药物在损伤肿瘤细胞的同时也干扰机体的免疫系统。化疗后荷瘤机体内的免疫格局形成对肿瘤的复发、进展等有重要意义。髓系来源抑制性细胞(Myeliod Derived-suppressor Cells, MDSCs)是诱导机体产生免疫抑制的重要细胞,并成为肿瘤诱导的免疫耐受的研究热点之一。MDSC作为一群未成熟的免疫抑制性细胞在包括肺癌在内的多种肿瘤机体中异常聚集,这与体内的诸多调节性因子发生变化有关。活细胞损伤释放出具有免疫调节活性的损伤相关分子模式(Damage Associated Molecular patterns, DAMPs),半乳糖凝集素一3(Galectin-3)是凝集素家族中的一员,也是DAMPs中的主要成员之一。许多化疗药物在体外可直接影响MDSC的聚集和分化,顺铂作为肺癌治疗的常用药物之一,对MDSC的作用尚不明确,其能否通过DAMPs的成员--Galectin-3来影响MDSC也有待阐明。因此,本实验通过建立Lewis市癌小鼠模型,观察顺铂对荷瘤小鼠体内MDSC及Galectin-3的影响,同时探讨Galectin-3对MDSC的分化、迁移及细胞活性的作用。[方法] (1)建立Lewis肺癌(LCC)小鼠模型,不同浓度(0.4mg/kg、4mg/kg)顺铂处理后,取小鼠肿瘤组织、脾脏和外周血,采用组织免疫荧光及流式细胞术(flowcytometry, FCM)检测肿瘤组织和脾脏中MDSC的数量,免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)检测肿瘤组织中的Galectin-3的浓度,酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测小鼠血浆中的Galectin-3的浓度。(2)培养Lewis肺癌细胞,应用免疫荧光(Immunofluorescence, IF)、FCM检测其Galectin-3的表达。顺铂处理前后,采用ELISA检测细胞培养上清液中的Galcetin-3的浓度。(3)CDllb磁珠分选荷瘤小鼠脾脏中的MDSC,采用Transwell小室检测Lewis肺癌细胞上清液及Galectin-3对MDSC的趋化作用,Western Blot、ELISA检测Galectin-3在MDSC中的表达。(4)CD1lb磁珠分选荷瘤小鼠脾脏中的MDSC,采用流式细胞仪通过Annexin V/PI法检测不同浓度(1uM、50uM) Galectin-3、不同时间(12h、24h)对MDSC存活状况的影响。(5)取小鼠骨髓,制成单细胞悬液,20ng/ml GM-CSF诱导其分化,在第2、4天应用流式细胞仪检测Galectin-3 (100ng/ml)干预对骨髓原始细胞分化方向的影响。[结果] (1)组织免疫荧光结果显示：MDSC在Lewis市癌小鼠模型的肿瘤组织中均有浸润,顺铂在一定的浓度范围内能显著升高肿瘤组织中的MDSC数量,与对照组相比,不同浓度组MDSC的升高均具有显著性统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪检测脾脏中的MDSC的数量结果显示,NS、0.4mg/kg、4mg/kg顺铂作用于荷瘤小鼠,随着浓度增大,脾脏中的MDSC的数量逐渐增多,MDSC在脾脏单细胞悬液中所占的百分率分别为4.1%、13.6%、26.7%。(2)免疫组织化学检测结果显示：对照组未经顺铂处理的荷瘤小鼠的肿瘤组织中,Galectin-3的染色强度较低,颜色较淡,阳性细胞数目较少；用药组染色强度明显增强,阳性细胞数目增多,阳性细胞呈现棕黄色颗粒,颗粒粗大,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA检测结果显示：顺铂处理Lewis肺癌荷瘤小鼠5天之后,小鼠外周血中的Galectin-3的浓度分别是1.58±0.87ng/ml、3.6±1.1ng/ml、 4.7±0.56ng/ml,比较处理组和对照组的浓度值,0.4mg/kg处理组与对照组差异无统计学意义(P>0.05),而4mg/kg处理组与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05),4mg/kg处理组与0.4mg/kg处理组相比差异无统计学意义(P>0.05)。(3) IF、FCM及ELISA检测Lewis肺癌细胞中Galectin-3的表达结果显示：Galectin-3在LCC细胞壁上和细胞质中均表达,在细胞膜的表达率为78.3%,在细胞质中的表达率为95.8%,且能分泌至细胞上清液中,顺铂干预24小时后,细胞上清液中的Galectin-3的浓度升高,对照组为9.23±2.54ng/ml,2uM顷铂处理组为14.26±2.16ng/ml,因此,LLC细胞能分泌Galectin-3到周围环境中,顺铂处理能使其表达增多。(4)采用Transwell小室检测LLC细胞培养上清液及Galectin-3对MDSC的趋化作用,结果显示：LL细胞上清液对MDSC具有趋化作用,加入抗小鼠Galectin-3抗体后显著降低其趋化作用,差异具有统计学意义(P<0.05)。采用ELISA及Western Blot检测MDSC由Galectin-3的表达结果显示：MDSC中存在Galectin-3的表达并且Galectin-3在MDSC细胞上清液中存在。(5)FCM检测Galectin-3在体外对MDSC存活的影响,结果显示,Galectin-3在luM、50uM浓度范围作用12h、24h内不能抑制MDSC凋亡,也不能诱导MDSC凋亡。(6)采用FCM检测Galectin-3在体外对小鼠骨髓细胞分化方向的影响,结果显示：Galectin-3能抑制骨髓前体细胞向成熟的树突状细胞分化,诱导MDSC生成。100ng/ml Galectin-3作用于骨髓前体细胞4天后,MDSC的比例为46.7%、DC为14.7%,对照组分别为22.8%、21.3%。[结论] (1)一定浓度顺铂干预后,Lewis肺癌小鼠中的MDSC数量增高,并在肿瘤微环境中聚集；肿瘤微环境及外周血的Galectin-3浓度升高。(2) Lewis肺癌细胞表达Galectin-3,顺铂体外处理后,表达升高。(3)肿瘤来源的Galectin-3在体外能引起MDSC聚集,说明Galectin-3在MDSC聚集过程中发挥一定的作用,同时,MDSC也表达Galectin-3,可形成正向反馈促使自身聚集。(4) MDSC在体外培养过程中发生凋亡,Galectin-3对此凋亡过程似乎没有影响。(5)Galectin-3能抑制骨髓细胞分化为成熟的DC细胞,诱导MDSC生成。(6)首次提出顺铂可以提高肿瘤微环境中Galectin-3的浓度,促进MDSC的聚集,从而为肺癌的综合治疗提供了新的线索。