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花粉管响应来自雌蕊的引导信号,通过在雌蕊中快速极性生长,把精核准确送入胚珠、完成双受精,是高等植物完成有性生殖的一个关键步骤。然而,在这一复杂的过程中,花粉管响应来自雌蕊的引导信号,以精确调整和控制自我的生长方向,确保准确地找到和进入珠孔的信号调控网络一直并不清楚。经过过去几十年的研究,人们普遍认为,存在于花粉管顶端的游离细胞质Ca2+离子浓度([Ca2+]cyt)梯度在花粉管极性生长及其方向调控中发挥着至关重要的作用,而质膜Ca2+通道被认为是该[Ca2+]cyt梯度建立、维持和调控的关键蛋白。但该Ca2+通道的遗传身份几十年来一直不清楚。目前人们推测编码花粉管顶端质膜Ca2+通道的基因主要来自于CNGCs(cyclicnucleotide gated channels)、GLRs(glutamate receptor-like genes)和Annexins等三个家族。有报道发现6个CNGC(CNGC7、8、9、10、16和18)和2个GLR(GLR1.2和3.7)在拟南芥花粉和花粉管中有较高表达。其中,CNGC18的T-DNA敲除突变体是完全致死的,而其它的5个CNGC和2个GLR的单突变体没有明显的表型。因此,我们推测CNGC家族,尤其是CNGC18,作为Ca2+通道在花粉管极性生长和导向调控中发挥关键作用。 为了验证此理论推测,我们首先在HEK293T细胞(human embryonic kidney293Tcells)中异源表达上述6个CNGC,利用膜片钳技术鉴定它们的离子通道特性。实验结果表明,这6个CNGC均对Ca2+、Ba2+等二价阳离子具有很强的通透能力,而对单价阳离子K+和Na+没有明显的通透能力,表明这6个CNGC均为典型的Ca2+通透性通道。为了研究CNGCs在花粉管生长和导向调控中的机理,我们收集并得到了cngc7、cngc8、cngc9、cngc10和cngc16的T-DNA插入敲除纯合突变体,但未能获得cngc18 T-DNA插入敲除纯合突变体。因为已有的报道表明,CNGC18的T-DNA插入敲除使雄配子完全致死。我们因此转换策略,收集了多个cngc18的点突变体。对上述拟南芥突变体的表型分析表明,cngc7、cngc8、cngc9、cngc10和cngc16的育性与野生型Col-0(Columbia-0)无显著差异,表明这几个CNGC基因的单突变不显著影响拟南芥的育性。我们同步分析了多个cngc18点突变体,发现了5个株系表现为角果短小的表型。我们将其中两株cngc18点突变体分别命名为sgs1和sgs2,重点用于进一步的研究。其中sgs1和sgs2的平均每个角果的种子数量约分别相当于野生型Col-0的10%和50%。花粉管体外萌发实验表明,在培养基2mM Ca2+条件下,sgs1和sgs2的花粉萌发率显著低于野生型Col-0,而sgs1和sgs2的花粉管平均长度和野生型Col-0没有显著差异。更为有趣的是,sgs1花粉管出现明显分叉的表型,其分叉比例为19.3%,显著高于野生型Col-0的0.6%。在10mM Ca2+的培养基条件下,sgs1和sgs2的花粉体外萌发率和平均花粉管长度均与野生型Col-0无显著差异,且sgs1花粉管分叉表型被显著抑制,说明sgs1和sgs2的表型与Ca2+内流密切相关。而cngc7、cngc8、cngc9、cngc10和cngc16等功能敲除突变体的花粉萌发率和花粉管伸长生长均与野生型Col-0无显著差异。 我们运用限量授粉和花粉管苯胺蓝染色等技术进一步研究发现,cngc7、cngc8、cngc9、cngc10和cngc16的突变体花粉管准确进入胚珠珠孔的比例分别为84.6%、84.2%、83.7%、84.0%和85.7%,与野生型Col-0(83.6%)无显著差异。但sgs1和sgs2突变体花粉管准确进入珠孔的比例分别为41.8%和46.5%,显著低于野生型Col-0。这些结果说明在这6个CNGCs和2个GLR中,CNGC18在花粉管响应胚珠引导信号而精细调控花粉管生长方向过程中发挥着最核心的作用,其功能相较于其它5个CNGC和2个GLR,居于显著的优势地位。 为了进一步研究CNGC18在花粉管顶端是否确实作为一个质膜Ca2+通道而发挥功能,我们采用膜片钳技术检测了花粉管顶端亚原生质体质膜Ca2+通道的活性。我们在野生型Col-0的花粉管原生质体中,成功记录到了cGMP激活的内向Ca2+电流,而该电流在sgs1的花粉管原生质体中明显缺失,提示CNGC18的这一点突变导致cGMP对CNGC18的激活能力被抑制。为了证明这一推测,我们进一步在HEK293T细胞中异源表达该点突变CNGC18基因SGS1,结合膜片钳技术对SGS1的离子通道活性进行了检测。结果显示,cGMP能够激活正常的CNGC18,而不能激活SGS1。这一系列实验结果表明,CNGC18确实是作为质膜Ca2+通道参与介导花粉管顶端Ca2+的内流,从而调控花粉管的生长和方向,而sgs1点突变则通过导致其Ca2+通道活性被抑制,从而影响花粉管导向。同时我们进一步运用[Ca2+]cyt活体成像技术,对花粉管顶端[Ca2+]cyt梯度的动态变化进行了检测,发现sgs1突变改变了花粉管顶端的[Ca2+]cyt振荡的特征,进一步支持了这一结论。 为了进一步证明CNGC18的生物学功能,我们进一步构建了功能回复拟南芥突变体。实验发现,功能正常的野生型CNGC18在sgs1植株中的表达成功回复了sgs1的育性缺失表型,包括体外花粉萌发、花粉管生长、花粉管分叉,以及体内花粉管导向的迷失表型等均回复到野生型的正常状态。另一方面,我们还同步构建了在CNGC18的启动子驱动下分别表达其它5个CNGCs和两个GLRs的sgs1转基因拟南芥植株,并且发现该转基因植株的表型与sgs1突变体一致,而与野生型col-0差异显著,说明其它5个CNGCs和2个GLRs不能替代CNGC18的功能。这些证据进一步证明,CNGC18是花粉萌发、花粉管生长和导向调控的关键Ca2+通道,其它的5个CNGC和2个GLR居于相对显著次要的位置。 综上所述,我们运用遗传互补、膜片钳、[Ca2+]cyt活体成像技术和花粉管体内生长实验等手段,首次证实CNGC18作为一个质膜Ca2+通道,通过介导胞外Ca2+在花粉管顶端的内流,调控花粉管顶端[Ca2+]cyt的振荡,从而响应来自胚珠的信号,参与了花粉管的导向过程。同时CNGC18在花粉管导向过程中是一个关键的质膜Ca2+通道,其功能不能被其它的离子通道,包括CNGCs和GLRs,所替代,提示CNGC18相较于其它5个CNGC和两个GLR具有明显优势的功能或明显不同的功能。但这些不同为何,还需要进一步的深入研究。