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研究目的：
本研究利用体外培养的小鼠骨骼肌肌母细胞(C2C12)为细胞模型,以不同浓度肌酸溶液孵育分化五天的C2C12细胞,同时加以不同时间的一次性电刺激引起细胞收缩模拟运动刺激,探讨电刺激和补充肌酸两个因素对细胞内GLUT4基因水平、蛋白表达、信号通路的影响及其与骨骼肌糖代谢之间的关系,进一步探明肌酸调节糖代谢相关指标的信号通路以及为运动实践中补充肌酸提高运动成绩提供新的证据。
研究方法：
以C2C12为研究对象,将细胞置37℃,5％CO2+95％空气,饱和湿度的恒温培养箱中培养,当细胞长满至皿底95％时加入分化培养基(含2％马血清的DMEM)。以15V,30ms,3Hz的强度电刺激分化7天的C2C12肌管细胞60min、120min,即刻收样,检测细胞内糖原含量以及LDH的变化,以此作为确定电刺激时间的依据。
细胞分化5天后,以不同浓度肌酸孵育细胞48h,再以15V,30ms,3Hz的强度进行一次性电刺激。按照电刺激时间不同将C2C12细胞分为电刺激60min组和120min组。每个时间点具体分为对照组(K)、电刺激组(E)、0.5mM肌酸组(0.5Cr)、2mM肌酸组(2Cr)、0.5mM肌酸组+电刺激组(0.5Cr+E)和2mM肌酸组+电刺激组(2Cr+E),共计12组。电刺激结束即刻收样,测定C2C12肌管内糖原含量、葡萄糖转运载体4(GLUT4)mRNA含量及蛋白的表达,以及AMPK-α2mRNA含量。
研究结果：
(1)电刺激60min组,细胞内糖原含量略高于对照组,但无显著差异(p>0.05),电刺激120min组糖原与对照组相比出现显著下降(p<0.05)。LDH在对照组、电刺激60min组和电刺激120min组间均无显著差异(p>0.05)。
(2)电刺激60min,E组糖原略高于K组,其他各组与K组相比无显著性变化。0.5Cr+E组、2Cr+E组与E组相比也无显著性差异(P>0.05)。
电刺激120min,E组糖原与K组相比显著下降(P<0.05),其他各组与K组相比无显著性变化。0.5Cr+E组、2Cr+E组分别与0.5Cr组、2Cr组相比略有下降,但无显著性差异(P>0.05)。
(3)电刺激60min,E组、0.5Cr+E组、2Cr+E组AMPK-α2 mRNA水平与K组相比显著性升高(P<α.05)。0.5Cr组、2Cr组与K组相比无显著性差异(P>0.05)。
电刺激120min,0.5Cr+E组与K组相比显著性升高(P<0.05),其他各组与K组相比均无显著性差异(P>0.05)。
(4)电刺激60min,E组、0.5Cr+E组、2Cr+E组、0.5Cr组和2Cr组GLUT4基因与K组相比均极显著性升高(P<0.01)。
电刺激120min,E组、0.5Cr+E组、2Cr+E组、0.5Cr组和2Cr组GLUT4基因与K组相比均显著性升高(P<0.05)。
(5)电刺激60min,E组、2Cr组、2Cr+E组GLUT4蛋白与K组相比极显著升高(P<0.01),0.5Cr+E组与K组相比显著升高(P<0.05)。0.5Cr组GLUT4蛋白略高于K组,但无差异性差异(P>0.05)。
电刺激120min,E组、0.5Cr+E组与K组相比明显上升(P<0.05),2Cr组、2Cr+E组与K组相比出现极明显上升(P<0.01),0.5Cr组略高于K组,但无显著性差异(P>0.05)。0.5Cr+E组与E组相比明显上升(P<0.05),2Cr+E组GLUT4蛋白极显著高于E组(P<0.01)。
结论：
(1)电刺激(15V,30ms,3Hz)C2C12肌管120min,大量消耗了胞内糖原,同时没有引起细胞外LDH含量上升,说明该强度电刺激即能引起绝大部分肌管收缩,但没有造成细胞膜的大量损伤。
(2)电刺激C2C12肌管细胞60min、120min均能引起AMPK-α2亚型基因表达升高,GLUT4基因以及蛋白表达增加。因此推测一定强度的电刺激可能通过激活AMPK-α2,进而调节葡萄糖载体GLUT4基因以及蛋白表达,从而加快葡萄糖的摄取和转运,促进葡萄糖代谢。
(3)0.5mM、2mM肌酸孵育C2C12肌管细胞48h提高了GLUT4基因和蛋白表达,但对AMPK-α2基因表达无明显影响。这可能是由于肌酸引起细胞内水分滞留,细胞体积增大,通过其他通路上调了GLUT4基因表达和蛋白含量。
(4)电刺激与肌酸共同作用于C2C12肌管细胞激活AMPK-α2基因的表达,提高了GLUT4基因以及蛋白的表达。提示肌酸补充可能提高了运动对糖原和GLUT4基因以及蛋白的调节程度。