红曲菌（Monascus spp.）又称红曲霉,是一种丝状真菌,能产生多种次生代谢产物,在我国与东南亚地区有近两千年的应用历史。红曲色素（Monascus pigments,MPs）是红曲菌合成的一类次级代谢产物,以其安全、稳定、着色效果好、生产不受原料与季节限制等优势被用做食品着色剂。在我国,其销量逐年增加,是我国近年来增长速度最快的食品着色剂品种之一。然而,1995年法国科学家发现部分红曲菌菌株可以产生桔霉素（citrinin,CIT）污染红曲菌的发酵产品——红曲,因此开发不含CIT或低CIT的红曲产品是重要的研究课题。本课题组前期从某工厂获得一株能够高产MPs的红曲菌株J01,然而该菌株也能产生较高浓度的CIT。本课题的目标是根据现有对CIT生物合成途径的认识,通过基因敲除方法阻断或降低CIT的合成,从而获得高产MPs而不产或低产CIT的红曲菌株。本课题的主要研究结果如下:1.红曲菌株J01的分类学鉴定采用形态学和分子生物学相结合的方法,对红曲菌株J01进行分类鉴定。通过观察菌丝体以及孢子等结构,结合ITS和部分β微管蛋白序列分析,鉴定红曲菌J01属于紫色红曲菌（Monascus purpureus）。2.紫色红曲菌株J01基因敲除体系的分析与优化CIT与MPs的合成,依赖于基因组上相关合成基因的转录与表达。通过对紫色红曲菌J01中mRNA序列的转录分析,发现与CIT合成相关的16个基因在转录水平上均比较活跃,且测序结果表明其与目前已报道的CIT合成基因相似度超过99%,因此可作为为红曲菌基因敲除菌株。目前红曲菌基因改造比较成熟的方法是通过分生孢子来进行T-DNA转化。本研究测定了不同培养基以及培养天数对菌株J01产分生孢子数量的影响,发现在察氏酵母提取物琼脂培养基（Czapek yeast extract agar media,CYA）中培养5 d产生的分生孢子数最多,该条件可用于进一步基因改造。3.桔霉素合成基因pksCT与MRL2的敲除菌株构建根据现有对CIT合成途径的认识,pksCT与MRL2是合成CIT的关键基因。本研究以潮霉素B抗性基因（hph）为筛选标记,构建敲除载体pC-CIT和pC-MRL2,通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的红曲菌转化方法,分别对红曲菌J01分生孢子进行转化。通过对潮霉素B抗性平板上生长的菌落进行PCR与Southern blot验证,最终得到13株pksCT基因的敲除菌株△pksCT和3株MRL2基因的敲除菌株△MRL2。4.基因工程菌株产MPs与CIT能力的分析基因敲除菌株△pksCT、AMRL2与原始菌株J01在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potatodextrose agar media,PDA）、麦芽汁琼脂培养基（Malt extract agar,MA）、CYA 和25%甘油硝酸盐琼脂培养基（25%Glycerol nitrate agar,G25N）等4种红曲菌研究常用的培养基上培养10d后,菌落形态与生长速率上无显著差别。在28℃,120r/min培养条件下,△pksCT在马铃薯葡萄糖液体培养基（Potatodextrosebroth,PDB）中培养13 d后,胞内与发酵液中均检测不到CIT,且MPs含量也高于原始菌株J01。△MRL2在PDB中培养13 d后,胞内与发酵液中均检测不到CIT,且MPs含量与原始菌株J01相比无显著性差异。但是△pksCT和△MRL2在工业培养基（Monascus productionmedia,MPM）中所产MPs却明显低于原始菌株,原因可能是与培养基组分有关,有待进一步分析。