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粘细菌难以分离纯化是限制粘细菌资源开发的一个重要因素。研究表明许多粘细菌可以捕食其它类群的微生物,并以此作为唯一的营养来源,被捕食细菌的存在可以促进粘细菌子实体的形成,这一现象可以被用来提高分离纯化的效率。
本研究从新疆盐碱地筛选获得16株对粘细菌子实体形成具有较好促进效果的细菌,利用16S rDNA基因序列分析对该16株细菌进行了初步鉴定,其中9株为革兰氏阳性,7株为革兰氏阴性菌株。将16株细菌作为助长菌(被捕食菌)涂布或划线于CY平板上,直接诱导土壤粘细菌的分离,从25个新疆盐碱地土壤样品中共分离到55株粘细菌,结合分子生物学手段和形态学特征,初步将其归属为粘球菌属(Myxococcus)、珊瑚球菌属(Corallococcus)、Pyxidicoccus、孢囊杆菌属(Cystobacter)和侏囊菌属(Nannocystis)及6株尚未获得纯培养的疑似粘细菌,表明粘细菌在盐碱地土壤中普遍存在,但可培养的粘细菌种类比较少。同时,结果也表明以多种细菌作为被捕食菌株诱导粘细菌分离具有很好的效果,与传统方法比其出菌率高,操作简单,有利于下步的纯化。通过研究16株被捕食细菌与诱导的粘细菌的关系,发现总体上,革兰氏阴性细菌的诱导分离效果优于革兰氏阳性菌,但被捕食细菌种类能够显著影响所分离的粘细菌类群,如Pyxidicoccus只能被革兰氏阳性菌诱导分离。因此,增加被捕食细菌的种类可能诱导分离更多的粘细菌。现有实验室培养条件下粘细菌的分离纯化与其它微生物类群相比仍较为困难,生长非常缓慢,因此,利用传统的依赖于培养的方法进行粘细菌多样性研究的效率极低,亟需建立一种不依赖于培养的多样性研究方法。本研究利用PCR-DGGE分子生态学技术,建立起高效的研究粘细菌多样性的分子生物学手段。利用PCR-DGGE技术的关键是找到粘细菌中普遍存在的特异性基因,即对非粘细菌特异、而在粘细菌之间又保守的基因。滑行运动是粘细菌的普遍性特点,粘细菌的滑行运动由多基因控制:A型运动系统和S型运动系统,而mglA基因是A型运动系统和S型运动系统唯一共同的基因,因此,mglA基因是一个可能的靶标基因。基于mglA基因设计引物,利用设计的引物对mglA1F/5R和mglA4F/5R对纯培养的粘细菌进行特异性验证,发现18株供试粘细菌结果为阳性,而非粘细菌的17株细菌标准菌株显示为阴性。结果表明,设计的两对引物具有粘细菌特异性。在粘细菌特异性引物的基础上,通过对8株粘细菌模式菌株的PCR-DGGE分析,发现在变性剂梯度为40%~75%时,这8株粘细菌在DGGE图谱中呈现出了明显的差异。结果说明不同的粘细菌mglA基因在DGGE条件下存在差异性。最后通过对8个盐碱地土壤DNA进行PCR-DGGE分析,在变性剂梯度为40%~75%时,各土壤中的优势条带较多,各土壤间优势条带的差异较大。将优势条带进行切胶并克隆测序,比对测序结果。结果表明切胶的28条条带中除3个为奇异球菌外,其他的25个与粘细菌的亲缘关系最近(其中12个与已知粘细菌聚在一支,另外13个可能为侏囊菌亚目成员或粘细菌新资源),该方法可以最大程度地获取环境样品中的粘细菌多样性。因此,基于mglA基因的PCR-DGGE方法研究环境中粘细菌多样性具有可靠性和可行性。