研究背景内毒素(lipopolysaccharide,LPS)是一种威胁到人类健康乃至生命的病原菌相关模式分子,可引发多种疾病,临床病死率居高不下,然而针对这些疾病尚无理想治疗措施,亟需寻找有效的治疗药物。近年来,运用中药抗内毒素损伤的研究多有报道。本研究团队先期对凉膈散进行了深入研究,证实该方具有良好的抗内毒素作用。确定凉膈散及其他具有抗内毒素活性的中药或复方的物质基础是进一步开发应用此类方药的首要问题。建立中药抗内毒素活性筛选评价体系则是解决该问题之技术关键。本课题组采用卵黄囊显微注射LPS诱导,成功构建斑马鱼内毒素炎症模型。对于成分复杂,影响因素众多的单味中药或复方来说,斑马鱼内毒素模型是否适用,特别是在以提取物甚至水煎剂为研究对象时,能否及如何应用斑马鱼模型则是我们面临的新问题。目的完善LPS诱导的斑马鱼内毒素炎症模型,并基于该模型进行凉膈散君药连翘不同极性提取部位抗内毒素炎症筛选评价;凉膈散组分(连翘苷、大黄素、黄芩苷、甘草苷)抗内毒素炎症组方配伍研究,优选凉膈散抗内毒素组分配方,进而拓展斑马鱼内毒素炎症模型在中药抗内毒素活性筛选评价中的应用范围,也为凉膈散组分的开发应用提供实验依据。方法与结果1.基于斑马鱼模型的连翘不同极性提取物抗内毒素炎症活性筛选选取健康斑马鱼胚胎,浸泡给予不同浓度连翘提取物,记录并统计72 h内各实验组中斑马鱼胚胎的畸变率和死亡率,选择无毒性作用浓度作为最大安全浓度进行后续实验。斑马鱼胚胎卵黄囊显微注射LPS造炎症模型后,以浸泡方式给药治疗。与模型组相比,给予连翘不同极性提取物治疗组和地塞米松组(5μg/mL,阳性对照)均提高了 LPS感染斑马鱼幼鱼的生存率,说明斑马鱼模型可用于抗内毒素筛选。2.基于斑马鱼模型的凉膈散抗内毒素炎症有效组分配伍研究通过浸泡观察确定凉膈散中有效组分大黄素、连翘苷、黄芩苷和甘草苷的最大安全浓度,选用此浓度作为最高剂量。将四种组分的剂量分为三个水平进行正交设计分组,得到9个组分配伍给药组,同样观察72 h,均未对斑马鱼胚胎显示任何毒性作用,可进行后续实验。斑马鱼胚胎卵黄囊显微注射LPS造模后,使用不同配比的药物进行浸泡给药治疗。结果表明所有凉膈散组分治疗组均提高了 LPS感染斑马鱼幼鱼的生存率。其中,凉膈散组分治疗组中第4-8组与模型组相比具有显著性差异(P<0.05)。荧光实时追踪结果、苏丹黑染色和中性红染色计数结果说明凉膈散组分配伍可抑制斑马鱼中性粒细胞和巨噬细胞向炎症部位的迁移、聚集。RT-PCR结果表明凉膈散组分配伍抑制促炎介质IL-6、TNF-α的表达。根据上述结果,最佳配比组合为凉膈散配伍组分第8组。3.凉膈散组分最佳配比的环状RNA转录组测序收集最佳配比治疗后的斑马鱼幼鱼全鱼组织总RNA样本,进行环状RNA转录组测序及结果分析。比对基因库发现了差异表达RNA。KEGG和GO分析结果显示上述差异表达环状RNA可能参与了细胞凋亡、MAPK等信号通路的调控作用,主要涉及蛋白质—DNA复合物的组装、碳水化合物跨膜转运等生物学过程,各差异表达环状RNA的具体作用还需进行验证。结论1.采用浸泡给药的方式,基于斑马鱼内毒素模型对连翘不同极性部位提取物的抗内毒素炎症活性进行了评价,证明了该模型对于中药粗提物抗内毒素活性筛选的适用性。2.通过正交设计试验发现不同配伍的凉膈散组分均能保护LPS感染的斑马鱼并优选出最佳配伍比例,主要表现为提高生存率、延长其生存时间,同时观察到其抑制炎症细胞的迁移、聚集,抑制促炎因子TNF-α、IL-6的表达,为凉膈散组分的开发应用提供实验依据。此外,本研究还选取了正交分析得到的最佳配伍组合进行环状RNA基因组测序。根据差异表达环状RNA,采用KEGG和GO分析结果预测其潜在参与的生物通路及行使的主要生物学功能,测序数据将为进一步研究凉膈散组分抗内毒素机制研究提供线索。