新孢子虫病(Neosporosis)呈世界性分布,目前全球犬类中感染率为17.14%,因新孢子虫病造成的流产对全球畜牧经济造成了巨大损失。该病对牛的危害最为严重,主要临床症状为流产,胎儿出生体重低于平均体重,运动障碍等。新孢子虫(Neospora caninum)为顶复门寄生虫,感染宿主非常广泛,包括牛,马,绵羊,山羊等多种家畜,其特有的棒状体细胞器分泌的棒状体颈部蛋白和NcAMA1蛋白形成的运动结合体(MJ)在虫体入侵过程中起到非常关键的作用,本次研究以新孢子虫NcAMA1蛋白作为研究对象,探究与NcAMA1蛋白发生相互作用的宿主细胞蛋白。为筛选出Vero细胞与NcAMA1蛋白相互作用的蛋白,本次试验根据GenBank中公布的NcAMA1基因,设计引物,从新孢子虫cDNA中扩增NcAMA1基因,构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NcAMA1,通过自转录活性检测,毒性检测验证诱饵载体的可行性,并验证了诱饵载体在酵母菌株中表达情况。通过酵母双杂交技术,对Vero细胞cDNA文库进行筛选。构建NcAMA1基因的原核表达载体和筛选到的宿主细胞蛋白Tmed2的原核表达载体,在体外进行原核表达,得到两种蛋白后经过pull-down进行再次验证NcAMA1蛋白和Tmed2蛋白在体外可发生相互作用。最终利用RNA干扰技术和抗体封闭试验,检测Tmed2对新孢子虫的入侵产生的影响。结果表明,本次试验成功从新孢子虫cDNA中扩增出NcAMA1基因,经过验证构建的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NcAMA1无自转录活性,且对酵母菌株无细胞毒性,可以在酵母菌株中成功表达出NcAMA1蛋白。通过酵母双杂交技术成功从Vero细胞cDNA文库中筛选出与NcAMA 1蛋白相互作用的宿主蛋白细丝蛋白A(FLNA)和跨膜emp24域转运蛋白2(Tmed2)。成功构建了原核表达载体pGEX-4T1-Tmed2和pET28a-NcAMA1,在体外表达出Tmed2蛋白和NcAMA1蛋白,并通过pull-down技术验证了宿主细胞蛋白Tmed2和新孢子虫NcAMA1蛋白可以在体外发生相互作用。利用RNA干扰和抗体封闭试验,对Vero细胞进行处理后,检测虫体的入侵率均有所上升,表明本次实验筛选到的宿主细胞蛋白Tmed2在新孢子虫入侵过程中可能起到抑制作用,为探究新孢子虫的入侵过程提供了一定的科学依据。