结直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤,其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌,其发生率在我国有明显增加趋势。近些年来,虽然随着诊疗新技术的应用和化疗药物的不断更新,结直肠癌患者的预后得到了极大地改善,但是患者总的生存率并没有得到显著提高,主要原因是多数结直肠癌患者在行根治性手术前已出现了转移。我们前期研究证实长非编码RNA基因MALAT1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript1)即肺转移相关转录本1与结直肠癌转移关系十分密切,并且长非编码RNA基因MALAT1可通过调控转移相关靶基因在结直肠癌转移中起重要作用,其中AKAP9(A型激酶锚定蛋白9)基因是受MALAT1基因调控的重要靶基因之一。AKAP9是AKAPS家族中的一员。AKAP9蛋白定位于中心体、高尔基体等部位AKAP9基因定位于染色体7q21-q22,全长169.81Kb。AKAP9编码基因中的1-8外显子通过选择性剪接能产生多种异构体,其中包括AKAP450、AKAP350、AKAP120和Yotiao等,Yotiao是AKAPS家族中的功能最活跃的一员,能激活PKA促进Actin的表达。AKAP9与结直肠癌发病关系的研究尚处于起步阶段,关于AKAP9与结直肠癌转移的研究,国内外还未见文献报道。MALAT1调控AKAP9的机制以及AKAP9在肿瘤转移中的作用还不清楚。已有研究表明MALAT1可以通过调控细胞内SR蛋白而调控相关基因的可变剪接,因此我们提出MALAT1通过调控SR蛋白并激活AKAP9-PKA-EMT信号通路促进结直肠癌侵袭和转移的研究设想。本课题主要内容以下：一、检测AKAP9在结直肠癌细胞株和癌组织标本中的表达,初步探讨AKAP9蛋白的表达与结直肠癌的关系；二、利用逆转录病毒感染系统,过表达、敲低结直肠癌细胞MALAT1基因,通过RNA-FISH联合免疫荧光共定位分析技术、RNA-IP技术和Western blotting技术分析MALAT1是否通过与SR蛋白调控AKAP9基因。本论文主要着重研究AKAP9在结直肠癌细胞系和临床组织样本中的检测以及MALAT1对结直肠癌细胞SR蛋白的调控作用。第一部分AKAP9在结直肠癌细胞中的表达运用real-time PCR、和Western blot方法在基因和蛋白水平检测AKAP9在8种结直肠癌细胞株中的表达；同时应用细胞免疫化学S-P法,检测8株结直肠癌细胞中AKAP9蛋白的表达情况。real-time PCR和Western blot检测了8利,结直肠癌细胞株中AKAP9的表达,结果表明,real-time PCR和Western blot检测的结果比较一致。8株细胞中AKAP9均有表达,在高转移的LOVO、SW620中表达较强,在由南方医科大学病理科自建的具有高选择肝脏转移特性的SW480亚系SW480/M5细胞株中表达也较高,在结肠癌原发癌建系的SW480、HCT116、DLD1细胞株中为中低度表达,综上,AKAP9在转移性较高的结直肠癌细胞中表达明显高于无转移性或低转移性大肠癌细胞。细胞免疫化学检测AKAP9蛋白在结直肠癌细胞中的表达,结果表明：AKAP9蛋白表达的阳性信号定位于细胞浆内,在HCT116,SW480,DLD1细胞株中,基本上是阴性表达,而在LOVO,HT29, LSI74T,SW620,M5中,AKAP9在这5株细胞中明显表达高于HCT116,SW480,DLD1。第二部分AKAP9在结直肠癌组织中的表达及临床意义收集南方医院普外科54例新鲜结直肠癌组织和切缘正常粘膜组织(距癌变边缘10cm),手术切除后立即置于液氮中,常规-80℃冰箱冻存。进行realtime-PCR反应结果显示：配对结直肠癌组织中AKAP9基因在癌组织中比正常组织中表达高,差异具有统计学意义(P<0.05)其中AKAP9的表达与患者的年龄,性别,癌的分化程度无关,差异无统计学意义(P=0.751,0.328,0.953)但与患者的转移情况有关,差异有统计学意义(P=0.007)。同时收集南方医院病理科存档113例结直肠癌蜡块,所有标本均由资深病理专家阅片确诊,将蜡块做2um连续切片,免疫组化采用常规SP试剂盒检测不同分化程度原发部位结直肠癌及相应正常结直肠粘膜组织中AKAP9蛋白,发现其与结直肠癌转移的相关性。结果表明：AKAP9蛋白表达的阳性信号定位于细胞浆内,在正常结直肠粘膜组织内,基本上是阴性表达,在高、中、低分化的结直肠癌组织里,均有表达,AKAP9在癌组织中的表达高于正常组织。AKAP9表达的高低与病人的性别、肿瘤的分化程度没有显著性(P>0.05),但是AKAP9表达的高低与肿瘤的浸润程度差别具有显著性(P<0.05),AKAP9蛋白表达与结直肠癌的浸润程度高度相关,即AKAP9表达越高,结直肠癌浸润程度就越高。第三部分MALAT1对结直肠癌细胞SR蛋白及AKAP9的调控作用初步分析利用课题组前期建立的MALAT1核心功能区过表达载体pEGFP-C1-MALAT1/fgf已及pGPU6/GFP/NeoshRNA干扰载体,建立MALAT1核心功能区稳定的过表达细胞株和稳定干扰的细胞株。采用RNA-FISH联合免疫荧光检测MALAT1与SR蛋白在结直肠癌细胞中的表达,结果表明：MALAT1过表达稳定细胞株MALAT1-SW480-RNAa细胞中MALAT1mRNA表达量高,红色信号比较强,并且定位于细胞核,且与SR蛋白共定位比较多,与过表达稳定细胞株MALAT1-SW480-RNAa相比,稳定干扰细胞株MALAT1-SW480-RNAi红色信号比较弱,MALAT1mRNA表达量低,与SR蛋白共定位比较少。通过RNA-IP检测MALAT1与SR蛋白在结直肠癌细胞中结合和表达。结果表明：MAL AT1-S W480-NC-SRSF1-IP对照组、MALAT1-SW480-RNAi-SRSF1-IP实验组、MALAT1-SW480-RNAa-SRSF1-IP实验组三组的MALAT1与SR蛋白结合的m RNA差异显著(F=93.472,P<0.001),MALAT1-SW480-RNAa-SRSFl-IP实验组的MALAT1与SR蛋白结合的mRNA表达最高。采用荧光定量PCR和Western blot检测MALAT1与AKAP9的关系,结果表明：结果表明Western blot的结果与荧光定量PCR得出的结果较为一致,在AKAP9在MALAT1-SW480-RMAa细胞表达较高,在MALAT1-SW480-RMAi表达较低。结论：AKAP9在大肠癌细胞与大肠癌组织中均有表达,AKAP9的表达与大肠癌的浸润和转移相关；MALAT1基因可能通过调控SR蛋白调节AKAP9的基因表达。