骨肉瘤(osteosarcoma)是骨骼系统最常见的恶性肿瘤,其血行转移发生率高,进展迅速,预后差,是青少年致死的主要疾病之一。骨肉瘤的发生和演进是以癌基因激活和或抑癌基因失活为主的多基因异常累加的结果。研究发现,Src家族激酶(Src family kinases, SFKs)的异常表达和(或)活化对恶性肿瘤的发生发展起促进作用。Src蛋白与体内多条信号转导途径相联系,Src蛋白是各种信号途径的中心枢纽。研究证实,Src与骨肉瘤关系密切。当前,除了传统的靶向抑制剂会继续发展以外,寻找天然的、无毒副作用、高效的新型靶向作用药物,已成为研究热点。天然中药以其疗效广泛、确切、毒性低,受到国内外广泛的关注。在众多中药中,丹参酮IIA(Tanshinone IIA, Tan IIA)是目前研究的热点中药之一。丹参酮ⅡA能作用于Src,抑制破骨细胞分化。因此,丹参酮ⅡA可能是抗骨肉瘤的重要辅助药物。本项目组前期体外研究发现,丹参酮ⅡA能抑制骨肉瘤MG-63细胞迁移与侵袭,且具有浓度与时间依赖性。但有关丹参酮ⅡA抗骨肉瘤的机制仍不十分清楚。丹参酮ⅡA具有上述多重抗骨肉瘤作用,且能在其他细胞中通过多条信号通路发挥作用,这些信号通路大多能由Src蛋白介导,因此我们推测,丹参酮ⅡA的抗骨肉瘤作用机制,可能与Src有关。而在Src介导的多条信号通路中,MAPK/ERK、 PI3K/Akt途径中有多个蛋白涉及到骨肉瘤的生物学效应,因此有必要重点探讨丹参酮ⅡA是否通过调节Src介导的MAPK/ERK、PI3K/Akt途径抑制骨肉瘤的生物学作用。虽然目前已研制出Src抑制剂达沙替尼(dasatinib),并在细胞水平证实,达沙替尼可抑制骨肉瘤细胞Src磷酸化,可诱导骨肉瘤细胞凋亡,阻止细胞迁移及侵袭；在骨肉瘤裸鼠中,达沙替尼可完全抑制原发肿瘤中Src磷酸化,但无法阻止肺转移的进展。因此,有必要将丹参酮ⅡA与达沙替尼做比较,了解两者抗骨肉瘤效果有无差异。本课题拟以Src为出发点,以Src介导的MAPK/ERK、PI3K/Akt信号通路为主要研究对象,并以达沙替尼作为参考,研究丹参酮ⅡA抗骨肉瘤的作用机制,为丹参酮ⅡA抗骨肉瘤的理论研究及临床应用提供基础。包括以下四部分。第一部分骨肉瘤标本中Src及p-Src表达量与患者临床及预后之间关系的研究目的：Src及p-Src的表达与肿瘤的侵袭、转移密切相关,本研究旨在探讨上述蛋白在骨肉瘤中的表达情况,并对其相互之间关系进行研究,为了解骨肉瘤的发病机制和判断预后提供一定的理论依据。方法：本试验选取有随访资料的武汉大学中南医院、湖北省肿瘤医院2000年1月～2010年1月手术切除的骨肉瘤石蜡标本116例,同时选取良性骨软骨瘤20例。采用免疫组织化学SP法检测Src及p-Src在骨肉瘤、骨软骨瘤中的表达情况,探讨两者在良恶性骨肿瘤中的表达情况与患者临床特点及预后的关系。结果：骨肉瘤组中Src及p-Src的表达明显高于骨软骨瘤组(P<0.05)。两种蛋白质的表达水平、骨肉瘤患者临床分期、肿瘤转移与生存时间呈显著相关(P<0.05),而患者年龄及性别与生存时间无相关性。Src在骨肉瘤的表达水平与p-Src表达水平呈正相关。结论：Src及p-Src均可作为判断骨肿瘤恶性表型的辅助指标。联合检测Src及p-Src可有助于进一步判断预后。第二部分Src对骨肉瘤细胞生物行为学特性的影响目的：Src在大多数肿瘤中可以发挥着癌基因的作用。本部分主要研究转染Src-shRNA之后对骨肉瘤细胞的生物行为学影响。方法：采用慢病毒载体将Src-shRNA稳定转染至骨肉瘤MG-63和U20S细胞。RT-PCR检测Src mRNA的表达水平；western blot检测Src、p-Src、p-ERK1/2、p-Akt蛋白表达水平；CCK-8法和BRDU免疫荧光法检测细胞增殖能力；Transwell法和细胞划痕实验检测细胞侵袭和迁移能力；流式细胞仪技术检测细胞周期。结果：免疫荧光显示成功将Src-shRNA稳定转染至骨肉瘤细胞中。转染后成功下调了p-Src、p-ERK1/2、p-Akt的表达,但在U20S细胞中,Src蛋白及Src mRNA无明显改变,在MG-63细胞中,Src蛋白及Src mRNA轻度升高。转染后明显抑制了骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力；对MG-63细胞凋亡、增殖及细胞周期无明显作用,但能导致U20S细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡,抑制增殖。结论：Src在骨肉瘤中的癌基因作用体现在促进细胞增殖、侵袭和迁移,抑制细胞凋亡方面,但Src对细胞增殖、凋亡及细胞周期调控呈现细胞系之间的差异性。第三部分丹参酮ⅡA通过Src介导抗骨肉瘤的体外研究目的：文献报道丹参酮ⅡA能抑制Src蛋白表达,而Src能抑制骨肉瘤细胞的侵袭、迁移、增殖能力,促进骨肉瘤细胞凋亡。本部分以Src为出发点,研究丹参酮ⅡA抗骨肉瘤作用机制。方法：在稳定转染Src-shRNA的骨肉瘤细胞及正常骨肉瘤细胞中,分别加入丹参酮ⅡA、Src抑制剂达沙替尼以及丹参酮ⅡA联合达沙替尼处理骨肉瘤细胞。western blot检测细胞中Src、p-Src、p-MAPK、p-ERK1/2、p-PI3K、p-Akt蛋白表达量,RT-PCR检测Src mRNA表达水平,检测细胞周期、凋亡、增殖、侵袭、迁移能力变化。分别使用ERK抑制剂PD98059、Akt抑制剂LY294002处理骨肉瘤,处理后检测p-Src、p-ERK1/2、p-Akt表达量,检测细胞周期、凋亡、增殖、侵袭、迁移能力变化。结果：使用丹参酮ⅡA和(或)达沙替尼处理骨肉瘤细胞后,发现在MG-63细胞中,达沙替尼可使Src蛋白及Src mRNA表达轻度升高,能抑制p-Src、p-MAPK、p-ERK1/2、p-PI3K、p-Akt表达；在U20S细胞中,达沙替尼对Src蛋白及Src mRNA无影响,能抑制P-Src、p-MAPK、p-ERK1/2、p-PI3K、p-Akt表达。丹参酮ⅡA能在上述两种细胞系中抑制Src、p-Src、p-MAPK、p-ERK1/2、p-PI3K、p-Akt蛋白表达及Src mRNA表达。丹参酮ⅡA及达沙替尼联合处理组对上述蛋白的影响具有协同作用(p<0.05)。丹参酮ⅡA与达沙替尼相比,两者抑制p-Src、p-PI3K、p-Akt的能力无明显差异,但丹参酮ⅡA比达沙替尼能更有效的抑制Src、p-MAPK、p-ERK1/2 (p<0.05)。在U20S细胞中,丹参酮ⅡA及达沙替尼对骨肉瘤细胞增殖、凋亡的影响无明显差异,但丹参酮ⅡA能更明显的抑制骨肉瘤细胞迁移及侵袭能力；在MG-63细胞中,丹参酮ⅡA比达沙替尼能更有效的抑制细胞侵袭、迁移,丹参酮ⅡA能抑制MG-63细胞增殖、促进凋亡,而达沙替尼无此作用。采用MEK抑制剂与P13K抑制剂处理骨肉瘤细胞后,发现前者抑制细胞的侵袭、迁移作用更显著,后者抑制细胞增殖、促进凋亡的作用更显著。PD98059能显著抑制细胞中p-ERK1/2表达,对p-Akt、p-Src无影响,LY294002能显著抑制细胞中p-Akt, 对p-ERK1/2起部分抑制作用,对p-Src无影响。结论：在细胞水平,丹参酮ⅡA的抗骨肉瘤作用是由Src下游的MAPK/ERK及PI3K/Akt信号通路介导。丹参酮ⅡA与达沙替尼相比,能更全面的抑制骨肉瘤细胞的生物学行为。第四部分丹参酮ⅡA通过Src介导抗骨肉瘤的体内研究目的：我们在上一部分研究中已证实,在细胞水平丹参酮ⅡA能通过抑制Src蛋白及其介导的PI3K/Akt、MAPK/ERK信号通路发挥抗骨肉瘤的作用。本部分拟在体内证实丹参酮ⅡA能通过Src介导发挥抗骨肉瘤作用。方法：采用细胞悬液法对BLAB/C-nu/nu雌性裸鼠进行成瘤实验。成瘤成功后,经HE染色、X线片确认为骨肉瘤原位生长后,随机将20只荷瘤裸鼠分为两组。实验组给予丹参酮ⅡA灌胃,对照组给予生理盐水灌胃。处理两周后观察裸鼠的一般情况,通过瘤体HE染色、抑瘤率、肺转移发生率、X线片比较两组的差异。结果：采用细胞悬液法能成功制作裸鼠胫骨原位骨肉瘤模型,成瘤率100%。实验组抑瘤率达64.09%。与对照组相比,实验组瘤体缩小,瘤体重量降低,肺转移率低,HE染色见细胞核染色变淡、部分细胞高分化。实验组Src、p-Src、p-MAPK、p-ERK1/2、-PI3K、p-Akt蛋白表达降低,对照组中上述蛋白表达稍升高。生存曲线分析示实验组生存时间更长。结论：在动物水平,丹参酮的抗骨肉瘤作用是由Src下游的MAPK/ERK及PI3K/Akt信号通路介导。丹参酮能在体内发挥抗骨肉瘤作用,能抑制骨肉瘤肺转移。