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[背景]肺癌作为发病率与死亡率稳居榜首的原发性恶性肿瘤,具有恶性程度高,治疗成效不显著等特点。转移是导致病患生存质量不佳与存活率下降的主要原因,也成为临床治疗的一大难题。因此,从根源上扼制肿瘤的转移,成为肺癌的主要研究方向之一。肿瘤的转移过程错综繁杂,其中,以细胞连接与极性丧失及获得间质细胞表型为初始步骤的一系列特定程序的生物学过程至关重要,称为上皮细胞-间充质细胞转化(Epithelial to Mesenchymal Transition,EMT),主要以 N-钙黏蛋白(N-cadherin,N-Cad)、纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)及 EMT 相关转录因子 Twist、Snail 及 Zeb 家族表达增加,细胞粘附分子E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-Cad)表达下调,伴随波形蛋白(Vimentin,Vim)逐步转化为间充质细胞骨架为主要特征,促使细胞极性、基底膜连接及上皮或内皮细胞表型丧失,以协助恶性肿瘤的耐药、增殖、侵袭、转移与种植。EMT已成为肿瘤精准诊疗研究领域的热点。前期研究显示,多种转录因子在EMT的调控中发挥着重要的作用,其中,性别决定基因-相关蛋白结构域4(Sex determining Region Y-related(SRY)-type high mobility group(HMG)-box 4,SOX4)可通过转录与非转录作用调控多癌种EMT的发生与进展,但其在肺癌发生发展中的作用仍待深入研究。本文在前期工作的基础上,用细胞培养、实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction,QRT-PCR)及蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)等手段,通过体外实验探究了SOX4在正常及肺癌细胞的EMT中的作用及其机制,以期为研发肺癌新的生物标记物奠定实验基础。[目的]本课题以过表达和沉默SOX4基因为基本研究手段,观察SOX4对正常及肺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。探讨SOX4与EMT间的相互关系及其机制,为其在肺癌中的研究及药物研发提供理论基础,同时,为各类型肺癌的个体化诊疗提供新的生物学标志物和潜在的干预靶点奠定基础。[方法]1.构建pEX-2-SOX4过表达质粒、GFP空载质粒;以pGPU6为基础构建shRNA803、shRNA965、shRNA1081、shRNA2026 及 shNC。采用脂质体法转染正常上皮细胞与肺癌细胞,通过QRT-PCR及WB验证过表达和沉默效果。2.对16株细胞进行培养[正常上皮细胞(Beas-2b、16H3E);小细胞肺癌细胞(H446);肺腺癌细胞(95D、A549、H1299、H157、H23、H292、HCC827、SPCA-1、XWLC-05、MSTO-211H);肺鳞癌细胞(H226、SK-MES-1)、大细胞肺癌细胞(H460)]。通过QRT-PCR及WB筛选出SOX4基础表达量最高的四种病理类型肺癌细胞株各一株及一株正常肺细胞进行后续试验。3.通过细胞划痕法、Transwell迁移及侵袭实验、CCK8细胞增殖与平板克隆形成实验验证过表达及沉默SOX4基因后对细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。4.QRT-PCR及WB检测目的基因在细胞中成功表达后,EMT相关基因在转录与翻译水平的变化情况。5.QRT-PCR方法检测过表达及沉默SOX4基因后EMT相关因子(ADAM28、BMI1、CDH11、CK2、Claudinl(CLDN1)、CLDN10、CLDN2、Cofilin、CyclinD1、DIA1、E2FI、E-Cad、EIF4EBP1、FN、ILK、JAG 1、KRT8、LAMC2、LAMTOR3、MLC、MMP14、MMP2、MM4P3、MMP9、Myc、N-Cad、PAK1、PCBP1、PDPK1、Smad2、Smad3、Smad7、Snail、Snai12、Snai13、TGF-β1、TGF-β2、TJP1(ZO-1)、TJP2(ZO-2)、TLR4、Twist、Vim、WIFI、Wnt2、ZEB1、ZEB2、αα-SMA、β-catenin)在五株目的细胞中的表达情况。[结果]1.成功构建SOX4过表达质粒、GFP空载质粒、shRNA803、shRNA965、shRNA1081、shRNA2026 干扰质粒以及 shNC 空载质粒。用 Lipofectamine TM 2000 Reagent对细胞进行转染,在荧光显微镜下观察,并经QRT-PCR和WB验证,证实目的质粒的转染效率及沉默和过表达效果良好。2.成功培养16株肺正常上皮细胞与肺癌细胞,并经核酸与蛋白水平筛选出稳定且高表达SOX4基因的四种病理类型肺癌细胞株及正常肺上皮细胞株,分别是小细胞肺癌细胞株(H446)、肺腺癌细胞株(H157)、肺鳞癌细胞株(SK-MES-1)、大细胞肺癌细胞株(H460)和肺正常上皮细胞株(16HBE)。3.通过细胞划痕实验验证了 H157细胞在过表达SOX4基因后,迁移能力显著增强(P<0.05,1n=3),反之,沉默SOX4基因后,H157细胞迁移能力下降,而16HBE细胞无论是过表达还是沉默SOX4基因,相比对照组均无明显差异(P>0.05,n=3);通过Transwell迁移及侵袭实验发现SOX4基因过表达的细胞,其成功迁移与侵袭的细胞数明显增多(P<0.05,n=3);在CCK8与平板克隆实验中,过表达SOX4的肺癌细胞增殖速率较对照组有明显增强(P<0.05,n=3)。反之,沉默SOX4基因后,H157细胞增殖、迁移与侵袭能力明显下降(P<0.05,n=3)。4.对成功转染目的质粒的H157细胞进行EMT相关因子在核酸与蛋白水平的双重验证,发现E-Cad的转录与翻译都呈下调趋势(P<0.05,n=3),而N-Cad、FN、Vim及Snail表现为差异性升高(P<0.05,n=3),提示SOX4可抑制上皮表型因子的表达,上调EMT转录因子和间质标志物的表达;沉默SOX4基因同样证实了以上结果。5.通过QRT-PCR方法检测发现,过表达SOX4的五株细胞中,均有EMT正向调节因子 ADAM28、CK2、CLDN2、CyclinD1、EIF4EBP1、β-catenin 的表达增加,伴有EMT抑制因子E-Cad表达的下调。其余因子在各类型细胞中表达不一,具体如下:5.1 过表达SOX4的16HBE 细胞中,EMT 促进因子 CLDN1、CLDN10、DIA1、FN、JAG1、KRT8、LAMC2、LAMTOR3、MLC、MMP14、MMP2、MMP3、MMP9、Myc、N-Cad、PAK1、Smad2、Smad3、Snail、Snail3、TGF-β1、TLR4、Twist、Vim、Wnt2、ZEB1、ZEB2、α-SMA 表达升高,E2F1、LAMTOR3 表达下调,差异有统计学意义(P<0.05,n=3);EMT抑制因子PCBP1、Smad7、TJP1、TJP2、WIF1显著上调,差异有统计学意义(P<0.05,n=3)。5.2 过表达SOX4的H446 细胞中,EMT 促进因子 CDH11、CLDN1、CLDN10、DIA1、E2F1、FN、JAG1、MMP3、Snail、TGF-β2、Twist、Vim、ZEB1 表达上调,差异有统计学意义(P<0.05,n=3);EMT抑制因子Smad7、TJP1、TJP2、WIF1、PCBP1表达下调,差异有统计学意义(P<0.05,n=3)。5.3过表达SOX4的H157细胞中,EMT促进因子BMI1、CDH11、CLDN1、Cofilin、DIA1、E2F1、FN、ILK、JAG1、KRT8、LAMC2、LAMTOR3、MLC、MMP14、MMP2、MMP3、Myc、N-Cad、PAK1、PDPK1、Smad2、Smad3、Snail、Snail2、Snail3、TGF-β1、TGF-β2、TLR4、Twist、Vim、Wnt2、ZEB1、ZEB2、α-SMA表达上调,差异有统计学意义(P<0.05,n=3)。5.4过表达SOX4的SK-MES-1细胞中,EMT促进因子BMI1、CDH11、CLDN10、E2F1、JAG1、KRT8、MLC、MMP14、MMP2、MMP3、MMP9、Myc、Smad2、Smad3、α-SMA 表达增高,LAMTOR3、Twist、Wnt2 表达下调,差异有统计学意义(P<0.05,n=3);EMT抑制因子Smad7、TJP1、TJP2、WIF1表达上调,差异有统计学意义(P<0.05,n=3)。5.5过表达SOX4的H460细胞中,EMT促进因子BMI1、CLDN1、CLDN10、Cofilin、E2F1、FN、KRT8、LAMC2、LAMTOR3、MLC、MMP14、MMP2、MMP3、MMP9、Myc、N-Cad、PAK1、Snail、Snai12、Snail3、TGF-β2、TLR4、Twist、Vim、Wnt2、ZEB1、ZEB2、α-SMA 表达增多,差异有统计学意义(P<0.05,n=3);EMT抑制因子Smad7、WIF1、表达增多,TJP2表达减少,差异有统计学意义(P<0.05,n=3)。而在siRNA803沉默组中,前文所述因子表达水平与pEX-2-SOX4组相反。这些因子大都直接或间接通过Wnt/β-catenin参与肺癌EMT的调控。[结论]1.SOX4可通过影响EMT相关因子的表达促进肺癌细胞的增殖、迁移与侵袭,Wnt/β-catenin为其主要信号通路。2.SOX4有望成为小细胞肺癌、肺腺癌及大细胞肺癌EMT的主要标志物与诊疗的潜在靶点。