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杂草是导致农作物减产、品质下降的重要因素之一,每年导致全球农作物经济损失近1000亿美元。杂草防治以化学防治为主,烟嘧磺隆(Nicosulfuron)、硝磺草酮(Mesotrione)是杂草化学防治中两种重要的化学除草剂。烟嘧磺隆为乙酰乳酸合成酶(Acetol-actate synthase, ALS)抑制剂,是一种超高效、广谱的磺酰脲类除草剂,对多数一年生禾本科杂草、部分阔叶杂草及部分莎草具有较好的防治效果,主要用于玉米等地杂草防治。硝磺草酮为对羟基苯基丙酮酸双氧化酶(4-hydroxyphenyl-pyruvate dioxygenase HPPD)抑制剂,是一种高效、广谱的三酮类除草剂,对多数阔叶杂草及部分禾本科杂草具有较好的防治效果,对抗三嗪类和ALS抑制剂类除草剂杂草有特效,主要用于玉米等地杂草防治。本研究通过喷施烟嘧磺隆,筛选获得抗烟嘧磺隆草坪草——中华结缕草(Zoysia sinica Hance),发现该草坪草中可能存在对烟嘧磺隆具有抗性功能的细胞色素P450基因。利用水稻CYP81A6(DQ341412.1)、大麦和黑麦草各一种P450(AK363181.1, AF321855.1)的核苷酸保守区域设计引物,以中华结缕草基因组为模板扩增出约1.5Kb的DNA片段。进一步通过Tail-PCR获得中华结缕草的一种细胞色素P450基因,该基因全长1848bp,命名为KC3-1。利用农杆菌介导法将该基因导入水稻中表达,获得了30个KC3-1转基因转化株系。在KC3-1转基因苗生根阶段,将转基因幼苗转移到含0.1mg/L烟嘧磺隆的生根培养基中进行抗性预分析,结果表明KC3-1转基因水稻对烟嘧磺隆具有明显的抗性。水培KC3-1转基因幼苗,使用80mg/L的烟嘧磺隆进行抗性株系筛选,发现20个转化株系具有一定的抗性。将抗性株系转植到大田以后,喷施120mg/L烟嘧磺隆进一步筛选,发现7号转化株系(KC-3-1-7)的抗性最高。KC-3-1-7转化株系幼苗4～5叶期时,分别在温室水培、大田条件下对其抗烟嘧磺隆水平进行检测,结果表明KC3-1-7转基因水稻对烟嘧磺隆的抗性水平为240mg/L～320mg/L。杂草产生抗性是杂草防治中最严重的问题,不同作用机理的除草剂交替或混合使用是抗性杂草治理最有效的措施之一。为研究KC3-1基因在抗性杂草治理上的潜力,在KC3-1-7幼苗4-5叶期时,温室水培条件下选用水稻敏感的硝磺草酮、百草枯、禾草克、都尔等4种作用机理不同的除草剂大田正常使用浓度进行抗性筛选,结果表明KC3-1转基因水稻对硝磺草酮有抗性。幼苗4-5叶期时,温室水培、田间条件下对其抗硝磺草酮抗性水平进行检测,结果表明KC3-1转基因水稻对硝磺草酮的抗性水平为300mg/L～400mg/L。本研究所获得的KC3-1基因抗烟嘧磺隆、硝磺草酮两种作用机理不同的除草剂,其抗性水平大于或等于这两种除草剂田间正常使用浓度。利用2种不同杀草机理的除草剂可以更加有效防治杂草,延缓、降低抗性杂草发生风险。转基因抗烟嘧磺隆、硝磺草酮农作物的培育将极大拓宽除草剂烟嘧磺隆和硝磺草酮使用范围,也为修复被烟嘧磺隆或硝磺草酮污染的土壤、水体提供了新的选择措施。本项目的研究为发展新一代转基因耐除草剂农作物提供了重要的基因资源和技术基础。