嗜麦芽窄食单胞菌ZJB-14132催化合成普瑞巴林关键手性中间体的研究

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普瑞巴林(S-3-氨甲基-5-甲基己酸)是抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的结构类似物。它对神经病理性疼痛和癫痫治疗具有良好效果,使其销售额不断攀升,据统计,2014年销售额达51.68亿美元,具有广阔的市场前景。辉瑞公司在第二代普瑞巴林合成工艺中引入商品化脂肪酶Lipolase?,选择性拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CNDE),生成(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。但该工艺所用的商品化酶价格比较昂贵,因此本论文围绕高效拆分CNDE制备普瑞巴林手性中间体新酶源的获得这一目标,建立具有自主知识产权的绿色、高效普瑞巴林合成新工艺。研究从土壤中筛选获得1株能够高效拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯生成(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的菌株ZJB-14132,经形态观察、生理生化分析、16S rDNA测序及系统发育树分析,确定了该菌株为嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。对该菌底物特异性的研究结果表明,其产酶为酯酶。通过培养基单因素优化法确定了S.maltophilia ZJB-14132产酶的最优培养基成分:葡萄糖15.0 g/L,蛋白胨7.0 g/L,Mg Cl2 0.1 g/L,Na2HPO4 1.0 g/L;培养条件:装液量100 mL/500 m L摇瓶,接种量4.0%(v/v),初始pH 8.0,30°C,150 rpm;在上述的培养基及培养条件下,菌体干重可以达到6.88 g/L,酶活可以达到188.47 U/L,分别为优化前2.75倍和2.18倍。以ZJB-14132全细胞作为生物催化剂立体选择性拆分外消旋CNDE,考察了其催化条件。最终确定最佳催化条件:转化温度40°C,pH 8.0,200 mM的磷酸盐缓冲液,添加15%Triton X-100表面活性剂,在10 mL的反应体系中,当湿菌体量为0.5 g时,最适底物浓度为400mM,反应72 h,转化率为47%,生成188 mM产物。以上结果表明,S.maltophilia ZJB-14132在拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制备普瑞巴林关键手性中间体中具有重要应用前景,为建立廉价、高效、具有自主知识产权普瑞巴林化学-酶法生产工艺奠定基础。
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