顺铂是目前临床使用最为广泛的抗肿瘤药物之一,对睾丸癌、膀胱癌等有很好的治疗效果。一般认为顺铂进入细胞后易与核酸的嘌呤碱基共价交联造成显著的DNA损伤,从而阻碍基因的复制和转录,激活凋亡通路最终导致细胞死亡。然而顺铂同时也会带来严重的毒副作用,以及患者持续用药后产生的抗药性等并发症,极大限制了顺铂的抗癌谱。已知顺铂与DNA的交联方式以1,2-d(G*=pG*)和1,2-d(A*pG*)的链内交联为主,并有少量的1,3-d(G*pG*)长程交联和链间交联。在此认识基础上,为了揭示铂类药物的细胞内作用机制,早期研究构筑了一系列DNA探针,并以此发现了以HMGB1为代表的很多铂类药物损伤DNA的识别蛋白质。但这些DNA损伤识别因子还不能够完整的揭示顺铂的细胞信号响应网络。不仅如此,即使研究最为广泛的HMGB蛋白,在顺铂的细胞毒活性和耐药性等事件中所扮演的角色仍存有争议。这就需要建立新的研究方法,从不同的角度去探索铂类药物的活性和分子机理。为此我们构筑了基于顺铂、奥沙利铂及其类似物的P1-4,以及基于三核铂配合物的TP1-5等9个DNA探针用于亲和分离其细胞内结合蛋白,以期通过鉴定相关通路的关键蛋白质发掘细胞响应铂类药物刺激的信号网络。多聚组氨酸标签(His-Tag)通常用于重组蛋白质的亲和纯化,具有简单高效,背景吸附少和纯化条件温和等优点。因此,我们在Pt-DNA加合物的双链末端共价交联一段His-Tag,形成一个DNA-多肽杂交探针。实验证明该探针可在细胞抽提物中结合损伤DNA识别蛋白质且可以被亲和介质分离纯化。为了消除细胞中大量存在的DNA结合因子的干扰,我们通过设置不含铂的探针建立了一个有效的参照系统,可以差异显示高亲和力识别Pt-DNA加合物的蛋白质。在成熟的蛋白质组学技术帮助下,我们不但从卵巢癌细胞SKOV3中成功鉴定了HMGB等已知的Cisplatin-DNA结合蛋白,而且发现了其他几种新的蛋白质,例如SFPQ,核糖蛋白hnRNP DO等。非常有趣的是,进一步的研究发现Cisplatin-DNA口合物的主要识别蛋白HMGB1存在丰富的翻译后修饰。在本研究中HMGB1至少有四种修饰亚型被分离鉴定出来,其中亚型A和B存在多个乙酰化位点,而C和D属不同模式的磷酸化,对Cisplatin-DNA加合物表现出相当高的亲和力。我们推测HMGB1不仅增强了顺铂损伤DNA和其他修复蛋白质之间的亲和力,而且可以通过蛋白质-蛋白质相互作用招募修复蛋白和其他相关因子,而这些相互作用都受到HMGB1翻译后修饰的严格调控。此外,我们通过探针P2,P3,P4与P1的对比研究,发现尽管DNA交联方式一致,但随着配合物非离去基团疏水性和位阻的增大,HMGB1蛋白对其Pt-DNA加合物的识别作用越来越弱。上述方法成功也应用于基于配合物[Pt3(HPTAB)Cl3](ClO4)3和MTPC与DNA长程交联方式构筑的探针TPl-4,在肺腺癌细胞A549抽提物中捕获的蛋白质与顺铂及其类似物有着很大的不同。实验结果证明Cisplatin-DNA主要的识别蛋白HMGB1/2无法识别三核铂的长程交联产物,这为后者不同的细胞毒活性机理提供了蛋白水平的解释。三核铂探针捕获的蛋白主要包括YBOX1, SFPQ, Annexin A2, S SBP, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1等在内的一批核酸结合蛋白。本文对这些蛋白的生理功能与DNA损伤细胞内响应机制之间的可能关联进行了初步探讨,但还还需要大量的生物化学实验去进一步研究。此外,我们从细胞水平研究了三核铂配合物[Pt3(HPTAB)Cl3](C104)3的作用机制。发现该化合物诱导一部分细胞经历了不同于凋亡的一种细胞死亡方式,分子生物学实验证明该化合物的细胞毒性不依赖于p53相关通路。流式研究结果发现[Pt3(HPTAB)Cl3](C104)3对于顺铂耐药性的肺腺癌细胞A549/cisR诱导凋亡的效果更明显,二者都可以引发细胞明显的活性氧物种生成,但三核铂MTPC则对于细胞内氧化还原环境没有影响。综上所述,本论文构筑了一系列新型的DNA生物探针,并利用这些探针从分子水平初步研究了顺铂、奥沙利铂及其类似物,以及一类新型多核铂配合物的抗肿瘤机理,鉴定了一批相关蛋白质。本研究发现识别顺铂损伤DNA的HMGB1/2存在广泛的蛋白质翻译后修饰,尤其HMGB1的磷酸化显著加强了蛋白质对损伤DNA的亲和力。蛋白亲和捕获实验和细胞实验结果证明了机体对顺铂和多核铂有着完全不同的响应机制。这些方法和结果为我们探索铂类抗肿瘤配合物的细胞作用机制提供了新的研究工具,有助于从蛋白质水平理解铂类配合物的作用机理。