研究背景:黄病毒科黄病毒属Flaviviridae登革热病毒（Dengue virus,DENV）,是登革热的致病原,其主要由蚊媒传播,高发于热带亚热带地区。截止到2020年,全世界有约40%的地区面临登革热感染的风险,进二十年来每年约有5000万至1亿人感染,近年来人数增长迅速,已达每年3.9亿人感染,死亡人数高达25000人。患者死亡的原因主要是登革热病毒感染会引发多种疾病如:隐性感染、登革热、登革出血热和登革休克综合征,表现为多器官衰竭、重症出血热等症状。由于登革病毒疫苗的ADE（Antibody-dependent enhancement）效应,疫苗研发困难重重,因此药物研发刻不容缓。虽然报道了许多针对DENV蛋白的小分子活性化合物,但由于病毒突变耐药和药物的副作用问题,目前还没有特异性的登革热病毒药物上市。而针对宿主自身的靶点稳定不易突变,因此针对宿主靶点的抗病毒药物开发对登革病毒感染重要的临床价值。血管内皮生长因子（VEGF）信号通路是病毒劫持宿主的过程之一。多种病毒可以编码与宿主细胞受体VEGFR2结合的VEGF同源物参与病毒感染的过程。VEGF和VEGFR2与DHF/DSS的严重程度、血浆渗漏相关。感染DENV的患者血管内皮细胞中检测到高水平的VEGF/VEGFR。抗VEGF/VEGFR疗法有潜在预防或改善DHF/DSS的可能性。VEGFR2又名KDR/Flk-1,具有酪氨酸激酶活性。VEGFR2在被激活后能够调控多种激酶的活性,并进一步调节多种细胞生命活动,如增殖等。已知能被VEGFR2 激活的激酶有 PI3K、FAK、MAPK（P38）等。AMPK即AMP依赖的蛋白激酶,能被AMP/ATP、LKB1等多种因素激活,调节细胞代谢。在DENV感染中AMPK通过抑制HMGCoA还原酶活性,导致内质网胆固醇升高,是病毒复制所必需的。此外,二甲双胍、PF-06409577等AMPK激活剂降低WNV,ZIKV和DENV感染。AMPK在DENV诱导的能量代谢中起重要作用,其机制尚不清楚。目前暂无较为深入的研究表明VEGFR2能够直接或间接作用AMPK。我们推测VEGFR2通过间接调节AMPK的活性参与了 DENV感染。本课题的研究目的旨在揭示DENV感染过程中VEGFR2的调控机制,探索VEGFR2抑制剂治疗登革热的可能性。研究方法:1.筛选有效治疗DENV2的治疗指数最优的VEGFR2抑制剂;2.RT-qPCR、Western blotting检测VEGFR2抑制剂Brivanib对病毒的抑制效果,检测其抑制病毒的作用模式;3.检测DENV2对VEGFR2活性的影响及Brivanib逆转DENV2影响VEGFR2变化及机制;4.CRISPR-Cas9敲除AMPK,检测Brivanib抗DENV2是否通过AMPK。利用免疫共沉淀（Co-IP）实验检测并验证VEGFR2与AMPK结合并改变其活性而抗DENV2;5.脂质质谱、油红染色、Filipin染色及检测脂质代谢关键蛋白ACC等方法检测Brivanib对DENV2引起的脂质变化的调节作用;6.基因缺陷鼠用于建立登革热小鼠模型并用于对Brivanib体内活性的检测。研究结果:1.VEGF/VEGFR抑制剂不同程度抑制DENV的复制,其中Brivanib是效果较好的抑制剂。2.DENV2引起NF-κB入核与VEGFR2启动子结合,调节VEGFR2表达水平。3.Brivanib抑制VEGFR2途径可以增加AMPK/ACC磷酸化水平,AMPK和VEGFR2相互结合,PTP1B可能是VEGFR2和AMPK的关键连接因子。4.Brivanib恢复了 DENV2感染后的脂质水平,并逆转DENV2引起的炎症反应。5.Brivanib治愈重症登革热小鼠,依赖激活后的AMPK调节。研究结论:我们发现了 DENV通过NS4A/NS4B促进NF-κB核转移结合VEGFR2启动子并上调其表达水平。PTP1B激酶参与VEGFR2介导的AMPK失活促进DENV传播。VEGFR2选择性抑制剂Brivanib调控AMPK磷酸化水平影响脂质水平,抑制了 DENV2在体内与体外的复制。此外Brivanib抑制了 DENV2引起的炎症反应。研究揭示了DENV2感染期间VEGFR2的详细变化机制,并评估了 Brivanib的抗病毒能力。