论文部分内容阅读
目的本实验在课题组前期对骨质疏松大鼠成骨细胞代谢变化的研究基础上,以IL-17F干预大鼠成骨细胞,进一步探究IL-17F对大鼠成骨细胞矿化功能的影响,以及对特异性转录因子Osterix及相关调节因子Runx2蛋白表达及对ERK通路激酶ERK1/2磷酸化水平的影响,探讨IL-17F对成骨细胞有否直接作用,及是否影响MAPK/ERK通路的激活,揭示其作用机制。方法1大鼠成骨细胞的分离、培养和鉴定采用酶消化法和组织块培养法分离提取新生24h内Wistar大鼠颅盖骨原代成骨细胞,采用差速贴壁法进行细胞纯化。用倒置相差显微镜观察细胞形态、生长情况,并采用碱性磷酸酶染色(钙钴法)进行细胞鉴定,取第4代成骨细胞进行研究。2实验分组与处理将第4代的成骨细胞进行分组处理和指标检测:2.1采用茜素红染色法检测IL-17F对成骨细胞矿化功能的影响分为两组:对照组和IL-17F组。对照组用含10%胎牛血清低糖DMEM培养基,实验组在培养基中加入100ng/mL IL-17F。培养10d后,用pH 4.3,0.1%茜素红染液进行矿化结节染色。2.2采用Western blot法检测Runx2、Osterix蛋白表达和ERK1/2磷酸化水平第一步,根据培养基中加入IL-17F的浓度分为6组:Ong/mL组(对照组)、1ng/mL 组、1Ong/mL 组、20ng/mL 组、50ng/mL 组和 100ng/mL 组。3d 后采用Western blot法检测成骨细胞中Runx2、Osterix蛋白表达和ERK1/2磷酸化水平。第二步,根据干预因素不同分为3组:对照组、DMSO组和U0126组。对照组用含10%胎牛血清低糖DMEM培养基,DMSO组和U0126组分别在培养基中加入10uM DMSO和10uM ERK信号通路抑制剂U0126(U0126溶解在DMSO溶液中)。24h后采用Western blot法检测成骨细胞Runx2、Osterix蛋白表达和ERK1/2磷酸化水平。第三步,根据以上两部分实验结果将细胞分为3组:对照组、IL-17F+U0126组和U0126组。对照组用含10%胎牛血清低糖DMEM培养基,IL-17F+U0126组和U0126组分别在培养基中加入100ng/mL IL-17F+10uM U0126、10uM U0126。24h后采用Western blot法检测各组成骨细胞Runx2、Osterix蛋白表达和ERK1/2磷酸化水平。结果镜下观察和碱性磷酸酶染色鉴定法均显示酶消化法和组织块培养法均能得到纯度在90%以上的成骨细胞。与对照组相比,IL-17F组成骨细胞矿化染色阳性区域明显增多,呈橘红色点状、片状或块状。1.不同浓度IL-17F对Runx2、Osterix蛋白的表达和ERK1/2磷酸化水平的影响与对照组相比,1ng/mL组、10ng/mL组和20ng/mL组成骨细胞中Runx2、Osterix蛋白的表达和ERK1/2磷酸化水平无明显变化(P>0.05);50ng/mL组成骨细胞中Runx2、Osterix蛋白的表达和ERK1/2磷酸化水平均升高,分别是对照组的1.16±0.22、1.219±0.13和1.317±0.07倍,差异有统计学意义(P<0.05);100ng/mL组Runx2、Osterix蛋白的表达和ERK1/2磷酸化水平均升高,分别是对照组的1.245±0.31、1.424±0.11和1.355±0.04倍,差异有统计学意义(PP<0.05)。与50ng/mL组相比,100ng/mL组成骨细胞中Runx2、Osterix蛋白的表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。2.DMSO和U0126对成骨细胞中Runx2、Osterix蛋白表达和ERK1/2磷酸化水平的影响与对照组相比,DMSO组成骨细胞中Runx2、Osterix蛋白的表达和ERK1/2磷酸化水平无明显变化(P>0.05);U0126组成骨细胞中Runx2、Osterix蛋白的表达和ERK1/2磷酸化水平均下降,分别占对照组的(72.91±0.04)%、(84.32±0.13)%和(78.80±0.16)%,差异有统计学意义(P<0.05)。与DMSO组相比,U0126组成骨细胞中Runx2、Osterix蛋白的表达和ERK1/2磷酸化水平均下降,分别占 DMSO 组的(70.2± 0.03)%、(83.4±0.08)%和(79.2± 0.12)%,差异有统计学意义(P<0.05)。3.U0126对IL-17F促Runx2、Osterix蛋白表达和ERK1/2磷酸化水平的影响与对照组相比,IL-17F组成骨细胞中Runx2、Osterix蛋白的表达和ERK1/2磷酸化水平均升高,分别是对照组的1.354±0.07、1.575±0.05和1.653±0.01倍,差异有统计学意义(P<0.05)。与IL-17F组相比,IL-17F+U0126组成骨细胞中Runx2、Osterix的蛋白表达和ERK1/2磷酸化水平均下降,分别占IL-17F组(74.4±0.09)%、(70.7±0.11)%和(61.3±0.02)%,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,IL-17F+U0126组成骨细胞中Runx2、Osterix蛋白的表达和ERK1/2磷酸化水平均无明显变化(P>0.05)。结论1、IL-17F能显著促进大鼠成骨细胞矿化功能、促进Runx2、Osterix蛋白的表达、提高ERK1/2磷酸化水平;ERK信号通路的抑制剂U0126能抑制IL-17F对Runx2、Osterix蛋白表达和ERK1/2磷酸化水平的促进作用。2、IL-17F促成骨作用可能机制是通过促进Runx2、Osterix蛋白的表达,而这一作用与提高ERK1/2磷酸化水平、提高ERK信号通路活性有关。