肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis,SE)是一类泛嗜性沙门氏菌,它不仅能引起肉鸡和蛋鸡的发病,造成严重的经济损失,而且是引起人类食物中毒的主要病原菌之一,在兽医公共卫生学上具有重要意义。菌毛结构在细菌致病过程中有着很重要的作用,研究表明菌毛结构与感染早期对宿主特定靶组织的定植和黏附有关,同时,它也能作为一种针对上皮细胞表面病原菌的潜在免疫原。肠炎沙门氏菌能表达多种菌毛结构,其中SEF14菌毛是90年代分离出来的,仅在肠炎沙门氏菌和都柏林沙门氏菌中表达。目前,关于SEF14菌毛的功能仍在探讨之中。为了研究SEF14菌毛的功能及其在肠炎沙门氏菌致病过程中的作用,本试验利用高效自杀性载体系统和Red同源重组系统对3种不同来源肠炎沙门氏菌(包括国内标准株50336、禽源分离株S.09以及人源分离株43)SEF14菌毛操纵子亚单位sefA和sefD编码基因进行敲除,并对这两种系统进行比较。本试验成功构建了肠炎沙门氏菌国内标准株50336、禽源分离株S.09以及人源分离株43的sefA和sefD基因缺失株各3株,并在△sefA缺失株的基础上又运用Red同源重组系统再次进行了sefD基因的缺失突变,构建了双缺失突变株△sefA△sefD各3株。高效自杀性载体系统需要构建含同源DNA片段的重组质粒并转化宿主菌,其一次重组效率高;二次重组只需用含5%蔗糖的平板传代即可进行抗性质粒丢失,且在染色体上不留任何痕迹,但重组效率低。而Red同源重组系统能将PCR扩增产物一步法直接转化入肠炎沙门氏菌,通过同源臂发生同源重组交换缺失sefD基因。由于对PCR产物和感受态细胞的质量要求很高,故一次重组率低,而二次重组则相对简单高效,最后在染色体上残留FRT位点。虽然两个系统都能对肠炎沙门氏菌染色体进行直接修饰,且都无抗性选择标志的残留,但实际操作中,Red同源重组系统较传统的高效自杀性载体系统更简便而高效。基于上述构建的SEF14菌毛缺失突变株,比较并分析3株野生株和其对应突变株△sefA、△sefD及△sefA△sefD与肠上皮细胞IPEC-J2的黏附试验,以及小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验和在巨噬细胞内的存活试验。结果表明:所有野生株及其相应突变株在试验4h内均能很好的与肠上皮细胞黏附,并随着时间的延长其黏附数量不断增多,但野生株与其相应突变株在黏附数量上的差异不显著,因而推测在体外试验中SEF14菌毛可能并不介导肠炎沙门氏菌与小肠上皮细胞的黏附。而在与小鼠腹腔巨噬细胞作用的4h内时,活化的小鼠腹腔巨噬细胞对相应突变株△sefA、△sefD以及△sefA△sefD的吞噬作用加强,且突变株在小鼠巨噬细胞中的存活能力提高。这一结果可能意味着SEFA和SEFD亚单位都能在体外试验中影响SEF14蛋白的功能,在SEF14菌毛的作用下,肠炎沙门氏菌能更好的作用于巨噬细胞并在巨噬细胞中存活,这将有利于肠炎沙门氏菌的隐性感染和长期排毒。