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肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,Kpn)是医院感染的主要革兰氏阴性致病菌之一,由其引起的医院感染约占总感染数的 10%以上。近年来肺炎克雷伯菌对抗菌剂的耐药性和耐药率以及由耐药株导致的医院感染逐年上升,尤其对氟喹诺酮类药物(fluoroquinolones, FQNLs)耐药性急剧增高。氟喹诺酮类药物是一类抗菌谱广和抗菌活性强的合成药物,自问世以来,因其结构简单、给药方便,与其它常用抗菌药物无交叉耐药性等优势,已迅速成为临床抗感染治疗的主要药物,用量已占抗感染药物总用量的 15%左右,并有继续增长趋势,Kpn 的耐药性将严重影响该类药物在临床的应用,由于院内 Kpn 感染的发生及流行多与各种医疗护理行为密切相关,因此研究和监测细菌对喹诺酮类药物的耐药性,对于指导和促进该类药物在临床的合理应用,加强和改进各种医疗护理措施以减少院内细菌感染有着重要的理论和临床意义。 既往研究表明,喹诺酮类药物的作用靶位为细菌 DNA 拓扑异构酶,包括 DNA 旋转酶(gyrase)和拓扑异构酶Ⅳ(topoisomerase Ⅳ,Topo Ⅳ),通常细菌对 FQNLs 发生耐药是由 DNA 旋转酶 A 亚单位 (GyrA)、拓扑异构酶Ⅳ(TopoⅣ)C 亚单位(ParC)基因发生突变导致。由于迄今有关肺炎克雷伯菌对不同亲水性或疏水性 FQNLs 耐药水平的高低是否与 DNA 拓扑异构酶的突变位点的不同存在差异尚不完全清楚,故本研究以第三军医大学第一临床医学院 2002 年 4 月-2003 年 3 月感染标本中分离到的 68 株肺炎克雷伯菌为研究对象,在确定其耐药谱的基础上,选择对环丙沙星和氧氟沙星不同耐药水平的 10 株临床耐药株和 1 株敏感株,并分别采用亲水性的环丙沙星和疏水性的司帕沙星在实验室诱导肺炎克雷伯菌耐药株,采用 PCR 扩增其氟喹诺酮耐药决定区(quinolone resistance determining region, QRDR),测序确定其 GyrA 基因(gyrA)和ParC 基因(parC)的突变点,分析其基因突变与氟喹诺酮类耐药之间的关系,了解不同理化性质的氟喹诺酮类药物(FQNLs)的耐药性发生及其主要作用位点是否存在差异。 研究分三部分进行: 1. 临床分离肺炎克雷伯菌耐药性流行病学调查 2. 临床分离肺炎克雷伯菌氟喹诺酮耐药株耐药基因决定区突变的研究 3. 肺炎克雷伯菌实验室诱导氟喹诺酮耐药株耐药基因决定区基因序列分析*基金项目:“十五”军队重点科研基金课题(No.01L065) 8<WP=11>第三军医大学硕士研究生论文1. 方法 1.1 用 K-B 纸片法测定临床分离肺炎克雷伯菌株对 16 种药物的敏感性,用复合纸片表型确证法检测其产超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum β-lactamases, ESBLs)的情况。 1.2 选择对环丙沙星和氧氟沙星不同耐药水平的 10 株临床耐药株和 1 株敏感株,测定其 MIC,针对肺炎克雷伯菌 DNA 旋转酶 gyrA 和 Topo Ⅳ的 parC 基因序列,设计引物,以受试的 11 株临床分离株的染色体为模板,进行 PCR 扩增,分析细菌 gyrA和 parC 基因突变的情况,分析其基因突变与细菌对氟喹诺酮类耐药之间的关系。 1.3 分别以亲水性环丙沙星和疏水性司帕沙星为诱导剂,实验室筛选 FQNLs 耐药株,选择 6 株不同耐药水平的诱导株, PCR 扩增和产物测序,分析细菌 gyrA 和 parC基因突变的情况。2. 结果 2.1 细菌对抗生素的敏感性和产 ESBLs 的情况 本研究中 68 株肺炎克雷伯菌株对美罗培南、亚氨培南 100%敏感,对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、复方磺胺甲基异恶唑等抗生素耐药率较高,为 85.2%-100%;对头孢噻肟钠、氨苄西林/克拉维酸、庆大霉素、头孢曲松、阿米卡星的耐药率次之,在 44.0%-67.6%之间;对头孢吡肟、头孢他啶、环丙沙星、氧氟沙星、氨曲南较敏感,耐药率在 29.3%-35.2%之间。对 ESBLs的检测共发现产 ESBLs 的菌株 28 株,占 41.2%。产 ESBLs 菌株对所测试的β内酰胺类抗生素(除 2 种碳青霉烯类外)的耐药率远较不产 ESBLs 菌株为高,对氨基糖甙类、喹诺酮类和复方磺胺甲基异噁唑等抗菌药的耐药率亦高于不产 ESBLs 株。 2.2 临床分离耐药株的 gyrA 和 parC 突变情况 除 1 株低水平耐药株外,其它 9株不同耐药水平的临床分离肺炎克雷伯菌均发生了 gyrA 和/或 parC 的基因突变。gyrA的点突变发生于 parC 的突变之前,单独的 gyrA 点突变可使受试菌株对 5 种 FQNLs的 MIC 水平大幅升高。未发现有不伴随 gyrA 只发生了 parC 突变的菌株,发生 2 个QRDR 突变的菌株对 FQNLs 的 MIC 较单突变的菌株高,而发生了 3 个突变的菌株的对 FQNLs 的敏感性较前两种情况更低。 2.3 氟喹诺酮诱导耐药株的 gyrA 和 parC 突变情况 亲水性的环丙沙星和疏水性的司帕沙星实验室诱导耐药株对所测试的 5 种 FQNLs 均发生耐药,提示不论是亲水性的 FQNLs 还是疏水性的 FQNLs,细菌均可在其作用后产生耐药性和交叉耐药性,随诱导剂量的加大,耐药程度越来越高,但同样浓度的 CIP 和 SPFX 诱导的耐药株对FQNLs 的耐药性不同。序列分析结果表明环丙沙星和司帕沙星主要作用靶酶均为gyrA,gyrA 突变点的累积和 parC 的突变一起使诱导株对 FQNLs 的敏感性显著?