皮肤鳞状细胞癌是起源于表皮角质所形成的皮肤附属结构的一种恶性肿瘤,皮肤鳞状细胞癌发病率在皮肤恶性肿瘤中仅次于基底细胞癌占居第二位,且近年来发病率呈增高趋势。尽管早期CSCC手术切除预后较好,但转移性CSCC病例因病灶位置及转移程度不同而难以治疗,部分病例死亡率超过70%。另外,对于好发于头面部的鳞癌患者,面临着创面缺损修补、美容要求及器官功能障碍等多方面挑战。因此,仍然急需研究其发病机理寻找新的生物学标记及治疗方法来诊断、缩小瘤体大小、抑制肿瘤侵袭和复发CSCC。WNT5a主要通过WNT/Ca²⁺和WNT/PCP途径参与非经典WNT通路。然而,WNT5a及其同源受体在癌症中的作用一直备受争议。依据不同的癌症类型,WNT5a具有促进或抑制肿瘤的作用。已有报道运用微阵列技术发现,与日光角化和正常皮肤相比,WNT5a在CSCC中表达升高。但是其具体作用及机制仍然不清。本研究利用全基因组RNA测序（RNA-seq）得出非经典WNT通路上的FZD4、PLCβ4、NFATc4基因在癌症中表达降低,而WNT5amRNA表达水平未见显著差异。本研究首先通过扩大组织样本对测序结果进行了验证,我们发现在CSCC中WNT5a、FZD4、PLCβ4、NFATc4表达降低。我们设想WNT5a可能通过结合FZD4,激活PLCβ4启动非经典WNT通路,在CSCC中发挥抑癌基因样作用。;然后通过慢病毒感染方式分别构建过表达WNT5a、FZD4、PLCβ4和NFATc4的A431和colo16细胞模型,从体内及体外两个方面行功能研究,我们发现WNT5a、FZD4、PLCβ4、NFATc4具有抑制细胞迁移、侵袭和促进凋亡的功能,并且能抑制裸鼠成瘤的能力。皮肤肿瘤的表观遗传学研究证实DNA甲基化异常与黑素瘤、皮肤基底细胞癌、CSCC、皮肤淋巴瘤的发生密切相关,相较于正常细胞而言,肿瘤细胞甲基化状态较低,肿瘤发生的重要原因之一为抑癌因子过甲基化,如p53。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶（DNMTs）（包括DNMT1、DNMTβA和DNMT3B）催化产生5-甲基胞嘧啶（5mC）,随后发现的双加氧酶TET通过三个连续的氧化反应将5mC转化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）,启动DNA去甲基化。甲基化和去甲基化之间的平衡受多种因素控制。在癌症中,这种平衡经常被破坏,导致甲基化改变。DNA甲基化的异常早于肿瘤的形成,且具有可逆的特点,因此DNA甲基化可作为肿瘤早期诊断、判断预后的标志之一,且可为肿瘤的治疗提供研究的靶点。我们通过简化甲基化测序（Reduced representation bisulfite sequencing,RRBS）和 RNA-seq 发现,CSCC 中 DNA 结合抑制因子 4（Inhibitor of DNA binding 4,ID4）基因甲基化水平显著升高、表达水平显著降低,这表明CSCC组织中ID4基因启动子区域甲基化差异与基因表达呈负相关。ID4是位于转化生长因子-β（transforming growth factor-beta,TGF-β）通路中 BMP-SMAD-ID 亚通路中最后一个位置的关键基因。而TGF-β信号通路具有维持干细胞内环境稳定、促纤维化等功能,在肝癌、胆管癌等肿瘤的发生、发展和转移过程中发挥着重要作用。近来研究表明,紫外线照射、人乳头瘤病毒感染等因素与皮肤鳞状细胞癌的发生和发展具有很强的相关性。在所有致病因素中,紫外线照射为主要诱因,有研究表明持续对小鼠进行UVB照射,会引起小鼠皮肤中的基因异常甲基化。因此我们推测ID4基因甲基化可能受UVB调控,UVB可能通过影响DNMTs或去甲基化酶来发挥作用。本研究从组织水平、动物水平及细胞水平对其进行了验证,证实了 UVB照射后或曝光部位ID4基因高甲基化,其表达水平降低,且UVB能够影响DNMT1和TET1-3的表达。另外,我们发现在40对CSCC和癌旁样本中,与癌旁组织相比,DNMT1表达升高,而TET1、TET2表达水平降低。第一部分RNA-seq、RRBS及扩大组织样本验证测序结果目的:获取皮肤鳞癌组织及其邻近正常组织样本完整的转录组图谱及DNA甲基化图谱,筛选出CSCC和癌旁组织中表达差异的基因、甲基化差异基因及差它们富集的通路,并通过扩大样本量验证测序结果,为下一步研究筛选通路及基因奠定基础。方法:1.使用RNA-seq和RRBS对8对CSCC和对应癌旁组织进行全基因组RNA测序和甲基化测序,应用 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信号通路富集性方法分析差异表达基因及甲基化差异基因富集的信号通路。2.应用实时荧光定量核酸扩增（Real-time Quantitative PCR,qPCR）验证WNT/Ca²⁺通路上 WNT5a、FZD4、FZD8、PLCβ4、PPP3CB、NFATc4 基因在CSCC组织和癌旁组织的的表达水平。3.运用结合重亚硫酸盐的测序法（Bisulfite Genomic Sequence,BSP）检测TGF-β信号通路中BMP4、BMP8B、BMPR2、SMAD9和ID4基因启动子区甲基化水平,采用qPCR方法检测BMP4、BMP8B、BMPR2、SMAD9和ID4基因在组织中的表达水平。结果:1.8对CSCC组织和癌旁组织共有1053个差异表达基因,其中包括123个表达一致上调的基因和930个表达一致下调的基因。KEGG信号通路富集性分析显示差异表达基因主要富集在神经活性配体-受体相互作用,代谢途径和钙信号传导途径。癌与癌旁组织存在显著的DNA甲基化差异。与对应的癌旁组织相比,WNT/Ca²⁺通路上的 FZD4、FZD8、PPP3CB、PLCβ4、NFATc4 低表达（p<0.05）,而WNT5a基因表达无显著差异（p>0.05）;与对应的癌旁组织相比,TGF-β信号通路中BMP-SMAD-ID亚通路上各个位置均有基因显著低表达（p<0.05）,且该通路最后一个位置的ID4基因甲基化水平显著提高（p<0.05）。2.扩大样本量验证发现FZD4表达显著降低（p<0.001）,WNT5a、PLCβ4表达降低（p<0.01）,FZD8、PPP3CB 和 NFATc4 表达降低（p<0.05）。3.扩大样本量验证发现ID4表达水平在癌症中显著降低（p<0.001）,甲基化水平升高（p<0.001）;BMP4、BMPR2、SMAD9 表达降低（p<0.01）、BMP8B表达降低（p<0.05）,而甲基化水平未见显著差异（p>0.05）。结论:CSCC与癌旁组织之间的基因表达及甲基化存在较大差异,能够筛选出表达差异基因和富集的通路,能够筛选出通过DNA甲基化修饰发挥关键作用的差异表达基因及通路。经过扩大样本量行RNA-seq、BSP验证发现FZD4、WNT5a、PLCβ4表达在癌症中显著降低,CSCC组织中ID4基因启动子区域甲基化差异与基因表达呈负相关。第二部分过表达慢病毒构建细胞摸型和功能研究目的:构建过表达WNT5a、FZD4、PLCβ4、NFATc4细胞模型,探究过表达目的基因对细胞功能及裸鼠致瘤的影响。方法:1.构建慢病毒质粒 LV-WNT5a、LV-FZD4、LV-PLCβ4、LV-NFATc4,将质粒包装成高滴度慢病毒。2.慢病毒感染CSCC细胞系A431和colo16,嘌呤霉素筛选2周,持续培养;通过 qPCR 及 Western Blot 检测慢病毒感染后 WNT5a、FZD4、PLCβ4、NFATc4 mRNA和蛋白表达情况。3.分别采用CCK8法、Awein-PI双染法、划痕实验、Transwell侵袭性试验比较感染前后各组细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭变化情况。4.裸鼠致瘤实验观察各组感染后细胞对体内致瘤影响。结果:1.成功构建WNT5a、FZD4、PLCβ4、NFATc4重组质粒,并将其包装成滴度分别为3×108、2×109、5×108、2×108TU/mL 的慢病毒。2.与对照组细胞相比,各目的基因mRNA及蛋白水平均出现显著升高。在过表达FZD4组,NFATc4表达水平在两种细胞均出现了明显升高（p<0.05）。在过表达NFATc4组,FZD4表达水平在两种细胞均出现了明显升高（p<0.05）。3.与对照组相比,上调FZD4、PLCβ4、NFATc4均可明显抑制A431、colo16的细胞增殖水平,上调WNT5a对细胞增殖水平影响不显著;上调WNT5a、FZD4、PLCβ4、NFATc4癌细胞组细胞迁移、侵袭能力下降,而凋亡水平增加。4.与A431对照组细胞相比,上调WNT5a、FZD4、PLCβ4、NFATc4组的A431细胞肿瘤体积明显缩小。结论:过表达慢病毒WNT5a、FZD4、PLCβ4、NFATc4成功感染A431和colo16,并且能稳定表达。FZD4和NFATc4能相互影响表达。上调WNT5a、FZD4、PLCβ4、NFATc4对CSCC细胞迁移以及对正常组织的侵袭具有一定的一致作用,除此之外,还能抑制肿瘤细胞生长。而上调WNT5a对细胞增殖影响不显著。第三部分UVB对CSCC中ID4基因甲基化的影响的研究目的:探究UVB对CSCC中ID4基因甲基化的影响及调控机制。方法:分别从组织水平（面部曝光部位和远处非曝部位正常皮肤60例）、动物水平（6-7周龄雄性C3H/HeN小鼠,剂量为150 mJ/cm2的UVB照射）、细胞水平（A431、colo16和HaCaT细胞进行UVB（10 mJ/cm2）照射）,分别采用qPCR和BSP方法检测曝光部位或者UVB照射后ID4、DNMT1、DNMT2、DNMT3、TET1、TET2、TET3的mRNA表达水平和ID4启动子区的甲基化水平变化情况。另外,选取40对CSCC组织样本和癌旁组织样本进行qPCR验证DNMT1-3、TET1-3 的 mRNA 表达水平。结果:在曝光部位或者UVB照射后,ID4基因的甲基化增强,而mRNA表达减弱（P<0.05）。在面部曝光部位和小鼠背部UVB照射后皮肤,DNMT1、表达水平升高（p<0.05）,而TET1-3表达均降低（p<0.05）;在A431和colo16接受UVB照射8h后,DNMT3A、TET1和TET2表达降低（p<0.01）。与癌旁组织相比,DNMT1表达水平在CSCC组织中显著升高（p<0.001）,而TET1表达水平显著降低（p<0.001）、TET2表达显著降低（p<0.01）。结论:在CSCC中,UVB可能是通过DNMT1、TET1、TET2影响ID4甲基化进而调控其表达水平。研究意义与创新性:1.本研究采用RNA-seq和RRBS方法获得了 CSCC全基因组转录信息和DNA甲基化图谱。分析得到CSCC与癌旁组织中差异表达基因和癌症相关的富集通路,及DNA甲基化修饰中起关键作用的差异表达基因和通路,为后期的深入研究提供思路。2.首次系统研究了 WNT/Ca²⁺通路相关基因在CSCC中的作用。我们发现FZD4和NFATc4能够相互影响表达水平。3.首次发现CSCC中ID4基因甲基化受UVB调控,并首次研究其调控机制。