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非核糖体多肽(nonribosomal peptides,NRPs)是通过非核糖体途径合成的一系列低分子量、具有多种药用价值的多肽类次生代谢产物。目前自然界中已发现的NRPs有1071种,对这些NRPs的组成、结构、功能和来源进行分析,旨在对未知功能NRPs的生物学功能进行预测,并设计出具有特定生物学功能的多肽。研究过程采用基本统计学方法和生物信息学方法,对不同结构、功能、来源中NRPs的数量进行统计,采用相关分析法分析结构、功能和来源之间的联系,通过对氨基酸使用频率的计算,阐明非核糖体多肽在氨基酸组成上的特点,以及这些特点与其结构、功能和来源的联系。 取得的主要研究结果如下: 1.非核糖体多肽的氨基酸单体数目分布在2~49范围内,集中分布于六肽~十一肽;其结构分为环状和链状,环状比例为69.7%,以单环状(40.5%)和部分环状(26.7%)为主;除peptide是主要类型(58.5%)外,还有lipopeptide,peptaibol和glycopeptide三种常见的多肽亚类,lipopeptide多作为抗菌素和表面活性剂使用,peptaibol和glycopeptide作用均为抗菌素;NRPs的功能以抗菌素(35.67%)和毒素(18.58%)最为常见,这与生物对外界环境的适应性有关,此外还有载铁蛋白、抗肿瘤、免疫抑制剂和表面活性剂等功能及其复合功能;NRPs主要来源于微生物,以细菌(49.21%)和真菌(25.30%)为主,此外,海绵动物(Porifera)来源的NRPs占19.14%。 2.行使载铁蛋白功能的多肽结构为链状和分枝状,其中分枝状多肽只行使载铁蛋白功能,推测链状和分枝状结构在载铁蛋白与铁离子结合的过程中发挥作用;来源于革兰氏阳性菌和海绵动物的NRPs在结构上有显著相关性(p<0.05),推测海绵动物体内的NRPs可能是与海绵动物共生的革兰氏阳性菌产生的。载铁蛋白和表面活性剂功能的NRPs只来源于细菌,主要是革兰氏阴性菌.(97.18%,73.91%),表明真核生物体内不能合成载铁蛋白和表面活性剂功能的NRPs。 3.脯氨酸(Pro)作为NRPs中使用频率最高的氨基酸,具有形成环状结构、维持构象稳定的作用;苏氨酸(Thr)在连接环与环、链与链、链与环结构中起重要作用;非核糖体多肽的合成必须进行修饰,对多肽链的修饰使多肽链环化,对氨基酸单体的修饰常见的有差向异构修饰(D-修饰)和N端甲基化修饰(NMe-修饰):NMe-修饰在环状结构中的使用频率(15.43%)显著高于线状结构(4.04%),随着多肽分子中环状结构比例的增加,NMe-修饰的频率也增加。非蛋白质氨基酸在环状结构中的使用频率(35.3%)低于链状结构(19.3%),随着多肽分子中环状结构比例的增加,NMe-修饰的频率减小,NMe-修饰氨基酸使用频率与非蛋白质氨基酸使用频率呈显著负相关(p<0.05);真菌中的D-修饰频率(3.6%)显著偏低,说明真菌在合成NRPs时对差向异构修饰的需求不高;细菌中的NMe-修饰频率(4.21%)亦偏低,说明细菌对N端甲基化修饰的需求也不高;载铁蛋白没有NMe-修饰,说明载铁蛋白的合成不需要N端甲基化修饰,相反,免疫抑制剂和表面活性剂的NMe-修饰显著偏高(21.59%,27.53%),相关性分析表明,行使免疫抑制剂和表面活性剂功能的NRPs在各类氨基酸的使用频率上有显著相关性(p<0.05)。 根据研究结果,我们总结出NRPs在组成、结构、功能与来源上的主要规律有: (1)在氨基酸数目上,抗菌素多肽的氨基酸数目在2~20均有分布,其余功能的多肽数目在13以下,其中抗肿瘤多肽没有二肽、六肽、十一肽、十二肽,毒素没有三肽,免疫抑制剂只有三肽、四肽、七肽、八肽、九肽、十一肽,载铁蛋白没有五肽,表面活性剂只有四肽、五肽、六肽、八肽和九肽; (2)在多肽结构上,抗菌素无分枝状结构,抗肿瘤多肽无双环、分枝状结构,毒素无分枝状结构,免疫抑制剂无双环、链状、分枝状结构,载铁蛋白无单环、双环结构,表面活性剂无双环、部分环、分枝状结构。分枝状多肽只行使载铁蛋白功能: (3)在生物体来源上,抗菌素无腔肠动物来源,抗肿瘤多肽无植物、脊索动物和腔肠动物来源,毒素无脊索动物来源,免疫抑制剂无细菌、软体动物、脊索动物、腔肠动物来源,载铁蛋白和免疫抑制剂只来源于细菌; (4)在氨基酸的使用上,抗菌素多肽不使用Met,抗肿瘤类NRPs不使用His,Lys,Asp,Glu,毒素类NRPs不使用Ala,Leu,Phe,Trp,Cys,Gln,免疫抑制剂类NRPs不使用Met,Ser,Thr,Cys,Ash,Gln,His,Lys,Asp,Arg,载铁蛋白类NRPs不使用Leu,Ile,Phe,Trp,Pro,Met,Cys,His,表面活性剂类NRPs不使甩Phe,Trp,Gly,Cys,Tyr,His,Lys,Arg; (5)在对氨基酸的D-修饰上,抗菌素无D-Met,D-Gln,D-His,抗肿瘤多肽无D-Met,D-Gly,D-Tyr,D-His,D-Lys,D-Arg,D-Glu,毒素类多肽无D-Trp,D-Met,D-Gly,D-Gln,D-His,D-Lys,免疫抑制剂仅有D-Ala,D-Val,D-Ile,载铁蛋白无D-Val,D-Leu,D-Ile,D-Phe,D-Trp,D-Pro,D-Met,D-Gly,D-Cys,D-Asn,D-His,D-Arg,表面活性剂仅有D-Leu,D-Phe,D-Tyr; (6)在对氨基酸的NMe-修饰上,抗菌素有NMe-Ala,NMe-Val,NMe-Leu,NMe-Ile,NMe-Phe,NMe-Gly,NMe-Tyr,NMe-Gln,抗肿瘤多肽有NMe-Ala,NMe-val,NMe-Leu,NMe-Phe,NMe-Gly,NMe-Tyr,NMe-Asn,NMe-Gln,毒素类多肽有NMe-Ala,NMe-Val,NMe-Leu,NMe-Ile,NMe-Phe,NMe-Trp,NMe-Gly,NMe-Ser,NMe-Tyr,NMe-Asn,NMe-Gln,免疫抑制剂只有NMe-Val,NMe-Leu,NMe-Gly,表面活性剂只有NMe-Ala,NMe-Val,NMe-Phe,NMe-Gly,NMe-Tyr,载铁蛋白没有NMe-氨基酸; 以上例举的主要是NRPs功能方面的规律,此外结构、来源方面还有其他很多规律,如真菌来源NRPs不含Phe以及酸性和碱性氨基酸,革兰氏阳性菌来源的NRPs不含Ile,完全由蛋白质氨基酸构成的环状多肽首尾必须至少有一个Pro,分枝状结构多肽不使用NMe-修饰,等等。 这些规律对我们预测NRPs的功能和指导环肽类药物的设计具有一定的借鉴意义。此外,我们以环孢菌素A为实验对象,对产环孢菌素A的菌种雪白白僵菌进行诱变育种。通过紫外诱变实验,我们测定了雪白白僵菌的最佳诱变时间为120s,同时通过抑菌圈测定实验和HPLC效价测定,最终获得了5株环孢菌素A高产雪白白僵菌菌株。