兔朊病毒蛋白的溶液结构研究

来源 :中国科学院上海药物研究所 | 被引量 : 0次 | 上传用户:cdxwindows
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朊病毒病是一类引起人和动物的中枢神经组织退化的疾病。朊病毒蛋白分子本身不能致病,必须经空间结构的变化转化为朊病毒才会损害神经元。在正常状况下PrP处于“细胞形态”(“cellular form”),简称PrPC,并不致病;导致疾病的PrP是处于“瘙痒形态”(“scrapie form”)的朊病毒蛋白,简称PrPSc。这两种不同形态的蛋白质由同一基因编码,具有完全相同的氨基酸序列,没有共价修饰的区别;但空间结构差异很大,导致理化性质差异很大。PrPC主要由α螺旋组成,表现为蛋白酶消化敏感性和水溶性;而PrPSc由β折叠占主要成份,约含40%,对蛋白酶消化具有显著的抵抗能力,并能聚集成淀粉样的纤维状结构。研究表明朊病毒病属于蛋白质构象病,涉及蛋白质分子的肽链错误折叠和空间结构的变化。   相同种属间的朊病毒病传染比较容易,而种属间的传染很难,甚至完全不能发生,即存在“种属屏障”。不同种属朊病毒蛋白同源性非常高,目前只有少数种属不感染朊病毒病。兔子是目前发现不感染朊病毒病的少数种属之一,它们不受从人、羊和小鼠脑病提取的感染物质的影响,而且能在一定程度上抑制小鼠异常态朊病毒蛋白PrPSc的扩增。本文利用异核多维核磁共振技术着重研究兔朊病毒蛋白及其突变体的三维结构和动力学,利用圆二色谱研究兔朊病毒蛋白的去折叠过程,为理解朊病毒致病机理研究提供有用的线索和依据。   本文作者用多维核磁NMR方法解析了兔朊病毒蛋白PrPC(91-228)的溶液结构,结构域124-228溶液构象系综之主链原子坐标和重原子坐标的均方根偏差分别为0.76和1.43 A。兔朊病毒蛋白PrPC(91-228)结构包括三段α螺旋(Hl:144-153,H2:171-186,H3:199-227)和一对反平行的β折叠(β1:128-130,β2:160-162)。通过T1、T2和NOE实验对兔朊病毒蛋白PrPC(91-228)的动力学行为进行了研究。分析了β折叠、loop165-172以及H3螺旋的C端、分子内氢键、盐桥等方面,发现:兔朊病毒蛋白β折叠上的氢键数目减少,β1折叠有所扭曲,动力学参数和半峰宽提示β折叠上的残基不存在明显的ms-μs慢交换;H3螺旋的C端有序度大,与残基165-172片断的远程约束增多;残基R163与D177之间的盐桥消失,增加了L124与D177、K193与E151、S221与D166、R227与和E220之间的盐桥,进一步稳定了兔朊病毒蛋白的空间结构。   本文作者还用多维核磁NMR方法测定了兔朊病毒蛋白突变体PrPC(S173N,91-228)和PrPC(1214V,91-228)的溶液结构。突变体S173N和突变体1214V的溶液结构与野生型差异不大,但H1,H2螺旋长度稍有变化,S173N的β折叠片稳定性降低,在残基片段191-194出现一个310螺旋。从氢键、表面电荷分布、远程约束等方面比较突变体与野生型,发现:兔朊病毒蛋白在突变后维持二级结构和三级结构的氢键数目减少,构象标识(conformation marker)位置的表面电荷分布发生变化,结构稳定性有一定程度的降低。由于这两个氨基酸残基是与小鼠朊病毒蛋白PrPC→PrPSc转变过程相关的两个重要的结构位点,因此比较这两个突变体与野生型的结构差异有可能为研究PrPC→PrPSc转变过程提供有用的信息。   研究朊病毒蛋白的二级结构变化有助于本文作者理解朊病毒病从以螺旋为主的PrPC向以折叠为主的PrPSc转变的致病过程。本文作者利用圆二色谱研究了兔朊病毒蛋白PrPC(91-228),PrPC(23-228)及其四个突变体PrPC(S173N,91-228),PrPC(1214V,91-228), PrPC(G99N,23-228), PrPC(M108L,23-228)的脲变性去折叠过程,发现在含150 mM氯化钠,pH4.0的缓冲溶液中,朊病毒蛋白的去折叠过程出现三种状态:天然态,中间态,去折叠态。小鼠等种属的朊病毒蛋白的中间态螺旋结构特征基本消失,表现出β折叠为主的结构特征,与PrPSc的结构特征有些类似,而兔朊病毒蛋白的中间态并没有表现出明显的β折叠结构特征,仍以螺旋结构特征为主。目前人们认为这个以β折叠结构为主的中间态可能与PrPC→PrPSc的转变有直接联系,因此兔朊病毒蛋白在一定尿素浓度中不出现以β折叠结构为主的中间态也可能是兔子不感染朊病毒蛋白的原因。兔朊病毒蛋白突变体脲变性去折叠过程的中间态都以螺旋为主,173和214两个残基位点发生突变后,蛋白的结构稳定性降低,PrPC(S173N,91-228)中间态平台最稳定。而全长的朊病毒蛋白PrPC(23-228)的两个突变体结构稳定性也有所改变,中间态的稳定性却稍微增加。
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