论文部分内容阅读
Chromodomain(chromatin organization modifier domain)是与染色质结构相关的功能蛋白结构域,直接参与异染色质的形成和动态调控。真菌、原生动物、植物、哺乳动物等不同进化地位的真核生物中同样含有chromodomain蛋白的存在,并且在进化过程中高度保守。Chromodomain通过芳香族氨基酸残基组成保守的疏水"box"结构与"组蛋白密码"中的二甲基或三甲基修饰的H3K9和H3K27结合,进而招募不同的下游调节因子形成多聚复合体,调控染色质的结构和功能。含有chromodomain结构域的蛋白在基因转录调节、基因组重排修复和染色质重塑等过程中发挥作用,控制表观遗传调节过程。嗜热四膜虫(Tetrahymena thrrmophila)中的 chromodomain 蛋白 Pdd1 和 Pdd3在有性生殖过程中特异表达,并且在四膜虫大核基因组重排中起到重要调节作用,本研究对嗜热四膜虫chromodomain蛋白Tcd1的功能进行了系统分析,结果如下:1.TCD1基因的生物信息学分析TCD1(TTHERM-01337400)在营养生长期和饥饿期不表达;进入有性生殖时期开始表达,并在配对8h～10h时表达量最高。基因全长2340bp,开放阅读框2172bp,编码723个氨基酸,含有3个内含子,在第3个内含子处经过选择性剪切产生另一转录本TCD1β。Tcd1含有2个chromodomain(CD 1,CD2)和 1 个 chromoshadow domain(CSD),与不同物种的 CD 和 CSD 序列比对显示,CD1、CD2和CSD进化上序列保守。2.Tcd1参与DNA重排和断裂修复敲除TCD1后,四膜虫细胞能完成有性生殖核发育,但不能产生可存活的后代。单细胞PCR检测IES删除情况,发现部分配对细胞中R元件的删除受阻。免疫荧光定位表明ΔTCD1细胞株中H3K9me2和H3K27me3的形成不受影响;但细胞核发育完成后新大核上仍能检测到γ-H2A.X免疫荧光信号。3.Tcd1和Tcd1β分别定位在大核和细胞质构建过表达Tcd 1和Tcd 1β的细胞株。免疫荧光定位分析表明,HA-Tcd1在有性生殖期早期形成点状结构定位;随着新大核形成,HA-Tcd1从亲本大核上消失并迅速转移到新大核上呈致密的分布;在发育的晚期,随着小核特异系列在新大核的删除,HA-Tcd1在新大核逐渐减少,并聚集为点状结构。Tcd1β在有性生殖的整个过程不能定位在亲本大核和新大核中,而是点状分布于细胞质中。4.CD1和CD2结构域共同决定了 Tcd1的核内定位模式构建CD1结构域单一位点突变的TCD1W159A细胞。免疫荧光定位表明在有性生殖早期HA-Tcd1W159A呈点状分布于亲本大核;但在新大核形成时期HA-Tcd1W159A不能全部从亲本大核转移至新大核,一部分保留在亲本大核上直至凋亡,在新发育的大核中聚集在核的外周;在发育晚期,HA-Tcd1W159A在核外周的定位进一步富集,核中心的定位消失。CD1和CD2双位点突变后,有性生殖早期HA-Tcd1W159AW437A在亲本大核形成较大的异常环状结构;新大核形成时聚集成点状分布,与H3K9me2几乎不能共定位;在细胞发育晚期,逐步聚集在大核周围。5.CSD结构域决定了 Tcd1的核内定位构建截短Tcd1的CSD结构域C端35个氨基酸突变体,截短后的Tcd1Δ35在亲本大核上能形成点状分布,在新大核上围绕核膜形成致密结构,类似于野生型。截短CSD结构域C端53个氨基酸后Tcd1Δ53在有性生殖时期不能定位在亲本大核以及新大核上,而是分散在整个细胞质中。本研究首次鉴定了四膜虫中TCD1存在两个不同转录本TCD1和TCD1β,Tcd1和Tcd1β具有不同的定位模式,Tcd1定位在亲本大核和新发育大核,而Tcd1β定位细胞质。TCD1敲除突变体进行正常无性生殖,但有性生殖后代不能存活。TCD1敲除的突变体细胞有性生殖过程中内部删除序列R元件的删除受阻,新大核DNA不能正常修复,表明Tcd1参与大核基因组重排和修复过程。突变Tcd1的chromodomain模体CD1影响Tcd1从亲本大核向新大核的转运;同时突变CD1和CD2后,Tcd1在亲本大核和新大核上的定位异常;截短C端CSD的53个氨基酸后Tcd1不能定位在细胞核上而是分布在胞质中,表明Tcd1的3个保守功能结构域具有不同的功能,共同决定了 Tcd1的定位和功能。