酒精滥用一直是西方国家导致严重肝脏疾病的首要因素,在我国,随着人群中嗜酒者比例的不断增长,酒精已成为继病毒性肝炎后导致肝损害的第二大病因。酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)具体发病机制仍未完全清楚,目前认为ALD是在个体遗传易感性基础上,乙醇通过本身或其代谢产物乙醛的直接毒性、氧化应激、免疫介导、细胞因子与内毒素以及病毒叠加等机制引起肝细胞损伤。我们前期通过建立慢性酒精性肝病大鼠模型,发现慢性酒精给予可引起大鼠原代肝细胞游离钙离子浓度(cytoplasmic free Ca2+concentration,[Ca2+]i)显著增加,线粒体渗透性转换孔(mitochondria permeability transition pore, MPTP)持续开放、跨膜电位△Ψm下降,诱导肝细胞的损伤和/或凋亡,提示肝细胞钙超载是乙醇诱导肝脏损伤的重要途径。乙醇诱导肝细胞[Ca2+]cyt升高的机制尚不清楚。研究发现乙醇可以通过抑制1,4,5-三磷酸肌醇受体(Inositol trisphosphate receptor, IP3R)降解途径致其表达量增高,增强激素诱导的Ca2+自内质网释放；慢性乙醇给予后氧化应激增强,细胞膜通透性增加,膜离子转运蛋白功能紊乱,使得胞外Ca2+内流增多；同时乙醇可以诱导肝细胞线粒体PTP呈高导性持续开放,使线粒体Ca2+大量外流,加重肝细胞钙超载。但是仍然存在以下问题尚未解决：由IP3R引起的胞质中Ca2+升高仅是一个瞬时变化,维持细胞钙超载的持续性因素尚不清楚；乙醇诱导后胞膜哪些离子转运蛋白功能紊乱介导了胞外Ca2+内流仍不能确定；很多研究表明胞内[Ca2+]cyt持续升高所致的线粒体Ca2+代偿性蓄积,是线粒体PTP高导性开放的重要原因,但前期胞内[Ca2+]i升高的途径仍未明确。钙池操纵的Ca2+通道(store-operated Ca2+channels, SOCs)是包括肝细胞在内的非兴奋细胞Ca2+内流的主要通道,在Ca2+参与的信号传导、细胞增殖、细胞凋亡等多种细胞活动中发挥着不可替代的作用。肝细胞中只有一种高Ca2+选择性SOC,被ER内腔Ca2+浓度降低激活而开放,生理作用在于补充ER的Ca2+而避免钙库Ca2+耗竭。间质相互作用因子1(stromal interaction molecule1, STIM1)及钙释放激活钙通道蛋白1(Calcium release-activated calcium channel protein1, Orial)是目前已确定的肝细胞SOCs组成蛋白,STIM1为内质网Ca2+浓度感受器,Orail是SOCs在细胞膜上的孔蛋白。基于乙醇引起肝细胞内质网释放Ca2+的实验观察及SOCs由内质网腔Ca2+浓度下降激活的生物学特性,本研究提出以下假设：SOCs可能参与乙醇诱导肝细胞钙超载病理过程,其作用可能是在乙醇诱导内质网Ca2+瞬时释放后,维持肝细胞胞外Ca2+持续内流,从而使胞内Ca2+浓度达到细胞损伤的程度。本研究通过建立体外乙醇诱导肝细胞慢性损伤模型及体内慢性ALD大鼠模型,利用通道阻断剂鉴定SOCs在乙醇诱导胞外Ca2+内流及相关损伤中可能发挥的作用；检测乙醇刺激对体内外肝细胞SOCs通道蛋白分子STIM1、Orail表达量及定位的影响,并检测SOCs通道蛋白STIM1、OrailRNA干扰对乙醇诱导肝细胞[Ca2+]i增高及相关损伤的影响,探讨SOCs发挥作用的具体途径。本研究分三个部分：一、钙池操纵钙离子通道参与乙醇诱导肝细胞Ca2+浓度增高及肝细胞损伤目的观察体外乙醇慢性刺激对人HepG2细胞Ca2+浓度、细胞存活率及细胞损伤影响,通过EGTA、2-APB、La3+对上述过程的干预,分析胞外Ca2+及钙池操纵的钙离子通道在慢性乙醇诱导肝细胞Ca2+浓度增高及肝细胞损伤中的作用。方法1.细胞培养：人HepG2肝癌细胞株,高糖DMEM+10%胎牛血清常规培养,当达到80-90%融合时传代,实验采用第4-8代细胞。2.实验分组：实验分为正常对照组(PBS刺激),乙醇慢性刺激组(浓度梯度分别为25mM、50mM、100mM、200mM、400mM、800mM,刺激24小时)；乙醇+EGTA处理组(EGTA浓度梯度分别为0.25mM、0.5mM、1mM),乙醇+2-APB处理组(2-APB浓度梯度分别为25gM、50gM、75gM、100gM),乙醇+La3+处理组(La3+浓度梯度分别为0.1gM、1gM、10μM)3.肝细胞[Ca2+]cyt检测：Fluo-3/AM或Fura-2/AM标记肝细胞Ca2+,流式细胞仪检测平均单个肝细胞[Ca2+]cyt,光谱扫描多功能酶标仪检测总肝细胞[Ca2+]cyt。4.细胞存活率检测：采用台盼蓝据染和CCK-8试剂盒两种方法观察乙醇刺激及EGTA、2-APB、La3+干预对HepG2细胞存活的影响。5.肝细胞损伤检测：收集各组肝细胞培养上清,全自动生化分析仪检测乙醇刺激及EGTA、2-APB、La3+干预对ALT、AST漏出含量的影响。结果1.乙醇刺激对HepG2细胞存活率及细胞损伤影响：0-800mM乙醇(刺激24h)浓度依赖性降低HepG2细胞存活率,增高细胞培养基上清ALT、AST漏出量。200mM乙醇刺激时HepG2细胞存活率为65.28±7.38%(台盼蓝)及67.83±4.41%(CCK8),因此选择200mM乙醇作为下一步的刺激实验浓度。2.乙醇刺激对HepG2细胞Ca2+浓度的影响：0-400mM乙醇浓度依赖性增高HepG2细胞胞浆游离Ca2+浓度,且光谱扫描多功能酶标仪检测总肝细胞[Ca2+.]cyt水平高于流式细胞仪检测的平均单个肝细胞[Ca2+]i水平。3. EGTA、2-APB、La3+干预对HepG2细胞Ca2+浓度的影响：EGTA、2-APB、La3+干预浓度依赖性降低200mM乙醇刺激HepG2细胞增高的[Ca2+]i水平,三者之间无统计学差异。4. EGTA、2-APB、La3+干预对HepG2细胞存活率及细胞损伤影响：与200mM乙醇刺激组相比,EGTA、2-APB、La3+干预浓度依赖性增高HepG2细胞存活率,降低细胞培养基上清ALT、AST漏出量,三者之间无统计学差异。结论1.体外乙醇慢性刺激浓度依赖性增高HepG2细胞Ca2+浓度并加重细胞损伤,可作为乙醇刺激肝细胞损伤的体外研究模型。2.胞外Ca2+内流参与乙醇慢性刺激HepG2细胞Ca2+浓度增高,由于EGTA、2-APB、La3+三者之间的干预效应无统计学差异,因此通过钙池操纵的钙离子通道的胞外Ca2+内流可能是其中的主要成分,且钙池操纵的钙离子通道介导的胞外Ca2+内流参与乙醇所致的肝细胞损伤。3. EGTA、2-APB、La3+干预不能完全抑制乙醇所致的HepG2细胞Ca2+浓度增高,因此除胞外Ca2+内流外,胞内钙库Ca2+释放也参与乙醇刺激所致的HepG2细胞Ca2+浓度增高及细胞损伤。二、体内外慢性乙醇刺激诱导肝细胞钙池操纵钙离子通道分子表达增高目的检测体外慢性乙醇刺激对HepG2细胞钙池操纵钙离子通道蛋白主要组成分子STIM1及Orail表达的影响,检测STIM1及Orail在慢性酒精性肝病大鼠模型肝组织中的表达、定位,分析STIM1及Orail与肝组织损伤的关系,探讨SOCs参与乙醇诱导肝细胞钙超载及相关损伤的具体途径。方法1.体外实验：人HepG2细胞株,高糖DMEM+10%胎牛血清常规培养,当达到80-90%融合时传代,种入6孔板,细胞贴壁后进行刺激。细胞分为正常对照组(PBS刺激),乙醇慢性刺激24h组、48h组、72h组。2.体内实验：40只成年雄性Wistar大鼠正常饲养1周后随机分为正常对照组及ALD模型组。模型组橄榄油拌平衡饲料喂养大鼠的基础上,大鼠给予每日两次白酒胃内灌注,白酒折算成酒精后其量及浓度每两周递增一次。正常对照组给予等量生理盐水每日两次灌胃。各组大鼠于16周全部处死。取肝组织标本,通过HE染色观察肝脏病理学改变。3. SOCs通道蛋白分子STIM1及Orai1表达检测：各组HepG2细胞及ALD大鼠肝组织提取总RNA及总蛋白,荧光定量-PCR和Western blot检测STIM1及Orail基因和蛋白表达,肝组织行免疫组化检测STIM1及Orail定位改变。结果1.体外慢性乙醇刺激对HepG2细胞SOCs通道蛋白表达的影响：与正常对照组相比,200mM乙醇刺激明显增加HepG2细胞STIM1及Orail的基因及蛋白表达量,且其表达增加持续至少72h。2.慢性酒精性肝病大鼠造模情况：与对照组相比,模型组大鼠精神萎靡、体重增长缓慢,肝重/体重比增加,肝组织HE染色可观察到肝细胞脂肪变性、气球样变、灶状坏死及炎症细胞浸润。3.慢性酒精性肝病大鼠肝组织SOCs通道蛋白表达：与正常对照组相比,ALD大鼠肝组织STIM1及Orail的基因及蛋白表达量明显增高,免疫组化显示正常对照组见少量STIM1及Orail阳性颗粒分布于中央静脉及汇管区周围,STIM1呈胞浆及胞膜表达,Orail呈胞膜表达,ALD模型组大鼠STIM1及Orail阳性颗粒明显增多,分布类似,主要分布于酒精性肝损伤中易受损的肝腺泡三区,STIM1呈胞膜聚集趋势。结论体内外研究均显示慢性乙醇刺激可增加肝细胞SOCs通道蛋白STIM1与Orail的表达,且两者呈平行性增加,提示乙醇可能通过增高SOCs通道蛋白分子表达,增加胞外钙离子内流而加重肝细胞损伤。三、钙池操纵钙离子通道蛋白RNA干扰对乙醇诱导肝细胞Ca2+浓度增高及肝细胞损伤的影响目的观察针对SOCs通道蛋白分子STIM1及Orail的RNA干扰对乙醇诱导肝细胞Ca2+浓度增高及肝细胞损伤的影响,进一步明确STIM1及Orail在SOCs参与乙醇诱导肝细胞钙超载及相关损伤中各自的作用。方法1.小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)设计合成筛选：根据在Genebank中检索的人STIM1、Orail基因序列,利用Sofld软件设计3对针对人STIM1、Orail基因的siRNA序列。应用阳离子脂质体2000转染HepG2细胞,Western Blot验证其对STIM1、Orail表达抑制的有效性,挑选抑制效应最强的siRNA进行下一步实验。2. STIM1及Orail的RNA干扰对乙醇诱导肝细胞Ca2+浓度增高及肝细胞损伤的影响：HepG2细胞,分别设立乙醇诱导组、干扰对照组、STIM1干扰组、Orail干扰组及STIM1/Orail共同干扰组,按照第一部分的方法进行肝细胞[Ca2+]cyt检测、细胞存活率检测及肝细胞损伤检测。结果1.STIM1、Orail SiRNA筛选：筛选出针对人STIM1、Orail的siRNA序列各一条,Western Blot验证可有效抑制STIM1、Orail蛋白表达,抑制效率在60-70%。2. STIM1及Orail的RNA干扰对乙醇诱导肝细胞Ca2+浓度增高的影响：针对STIM1及STIM1/Orail的RNA干扰可有效降低乙醇引起的HepG2细胞Ca2+浓度增高,且Si-STIM1/Orail组略低于Si-STIM1组,但单独针对Orail的RNA干扰不能有效降低乙醇引起的HepG2细胞Ca2+浓度增高。3. STIM1及Orail的RNA干扰对乙醇诱导肝细胞损伤的影响：针对STIM1及STIM1/Orail的RNA干扰可有效增高200mM乙醇刺激后HepG2的细胞存活率,降低200mM乙醇刺激后HepG2培养上清中ALT、AST的含量,但单独针对Orail的RNA干扰无显著作用。结论慢性乙醇刺激可能主要通过增高STIM1表达,增加SOCs通道开放的频率,使胞外钙离子内流增多,从而加重肝细胞损伤,同时乙醇刺激肝细胞Orail表达增多,使SOCs孔通道增多,以辅助STI1作用。