选题依据:抑郁症(Depression)是一种精神疾病,以显著而持续的心情低落为主要特征。本课题组是在经典名方“逍遥散”的基础上化裁,研发了中药新药柴归颗粒,其由柴胡、当归、薄荷、甘草、白术和白芍6味药组成,现已获得临床批件。化学成分是其发挥药效的物质基础,对中药复方所含的化学成分进行研究,考察其被吸收入体的成分及代谢物,对明确其药效物质基础具有非常重要的意义。前期本课题组对柴归颗粒的化学成分进行了初步的探索,本研究拟基于UHPLC-MS技术,更全面深入地建立柴归颗粒的体外和体内化学成分谱及其PK-PD相关性研究,为研究柴归颗粒的药效物质基础、临床安全性等研究提供科学基础。目的:建立柴归颗粒的体外和体内化学成分谱,明确复方中的化学成分及其进入体内的成分。方法:(1)通过标品对照及参考文献数据定性鉴别柴归颗粒UHPLC-MS色谱中的色谱峰,全面鉴定其化学成分。(2)通过外翻肠囊实验和单向肠灌流实验,考察小肠中空肠和回肠段对柴归颗粒化学成分的吸收特征,并分别采用正常组和CUMS组大鼠考察不同病理状态下大鼠肠道对柴归颗粒化学成分的吸收差异。(3)基于体外化学成分的鉴定,采用血清药化和脑微透析技术,研究柴归颗粒在血和脑中的吸收及代谢,全面考察柴归颗粒在体内的吸收代谢。(4)基于血清药代动力学和药效动力学,借助Compound Discoverer 3.0软件计算血清的外源性化合物和内源性代谢物,整合药物代谢动力学与药物效应动力学,研究PK-PD之间的相关性。结果:(1)利用UHPLC-Q-orbitrap-MS/MS技术建立了柴归颗粒的化学成分分析方法,通过一级色谱峰的保留时间和对应的二级离子碎片信息,并结合对照品的保留时间,共鉴定出95个化学成分,包括皂苷类,黄酮类,内酯类,萜类,苯酞类,有机酸类,香豆素类,鞣质类等。该研究基本阐明了柴归颗粒的中的主要化学成分类别,为其体内化学实验成分的研究奠定一定的基础。(2)通过外翻肠囊实验与单向肠灌流实验,研究小肠对药物成分的吸收。结果外翻肠囊实验中有70个成分能同时被小肠的空肠和回肠段吸收,通过比较正常大鼠与CUMS大鼠的吸收峰面积发现45个显著吸收差异成分,其中甘草查而酮B(P<0.001)和异甘草素(P<0.05)在CUMS大鼠回肠中分别增加近21倍和近43倍。单向肠灌流实验中有85个成分被小肠的空肠和回肠段吸收,通过比较正常大鼠与CUMS大鼠吸收峰面积发现10个具有显著性差异的吸收成分,分别为阿魏酸,芍药苷,柠檬酸,原儿茶醛,E-丁烯基苯酞,呋喃倍半萜类,甘草查而酮A,柴胡皂苷d,柴胡皂苷g和柴胡皂苷a。(3)对柴归颗粒体内代谢研究。在血清中发现28个原型成分和38个代谢物,脑中发现15个原型成分未发现代谢物。通过Compound discoverer 3.0数据软件分析,在血清中发现了芍药苷、5-羟甲基糠醛、白术内酯Ⅱ、Z-藁本内酯、甘草苷、阿魏酸、洋川穹内酯H、异甘草苷、甘草素、异甘草素和对羟基苯甲酸的代谢物产物,其主要发生氧化、还原、脱水、乙酰化、糖苷化、甲基化等代谢过程。(4)灌胃给予大鼠柴归颗粒后的PK-PD分析。结果发现了62种原型化合物和34种外源性代谢物。正常组和CUMS组间有33种相同的原型化合物和23种相同的外源性代谢物。通过参考文献和二级离子碎片信息鉴定了12种原型化合物。通过HMBD数据库结合二级片段离子片段鉴定出4种与药效有关的内源性差异代谢物。在PK-PD相关曲线中达到最血药浓度的时间为0.17-4h,而最大效应则产生在12h,说明药物浓度与效应之间存在明显的滞后现象。结论:1.通过对体外柴归颗粒化学成分研究,鉴别出95种化合物为下一步研究其进入体内后对化学成分的吸收研究奠定基础。2.通过外翻肠囊和单向肠灌流实验发现大部分的化合物都能被肠吸收,CUMS组与正常组存在显著吸收差异,具有显著差异的成分可能与抗抑郁有关。3.血清药化和脑微透析技术分别研究柴归颗粒入血和入脑的成分,发现入血的原型成分在肠段均能找到,入脑的成分在血清中也均能找到,说明药物是经过小肠吸收后进入到血液中,由血液运输至脑通过血脑屏障发挥抗抑郁作用。4.PK-PD相关性研究发现药效存在滞后性,柴归颗粒对CUMS大鼠有治疗作用,对正常大鼠几乎无作用,此与“有故无殒”思想一致,为柴归颗粒临床前安全性和有效性评价提供PK-PD依据。