源自噬菌体P1的Cre/loxP系统目前已被广泛用于原核、真核生物体内与体外DNA重组方面的研究,并且在基因功能的鉴定、基因捕获、染色体工程、特定基因的删除以及外源基因的整合等方面发挥着巨大功能.为了开展该系统的应用研究,该研究进行了两方面的工作.一方面提供了一种快速直观监测Cre/loxP系统在原核细胞体内重组效率的方法;另一方面设计了一种新型植物表达载体,该载体能够简便地用于检测转基因植物中选择标记基因的消除,同时保证目的基因的有效表达.为了简便地检测Cre酶在大肠杆菌中的重组活性,分别将cre基因和两边带有同向loxP的绿色荧光蛋白基因(rfp)克隆到具有不同抗性的两种不相容质粒中,构建了原核表达载体pET30a-Cre和pET23b-loxGFP,电击共转化大肠杆菌BL21(DE3),利用卡那霉素和氨苄青霉素双抗生素进行筛选.通过直接观察转化子绿色荧光的缺失与否,即可观察统计Cre酶的体内重组活性及重组效率.继而进一步通过质粒酶切、SDS-PAGE分析得到验证.结果表明:以gfp为报告基因、通过两种不相容性质粒共转化大肠杆菌可以为研究和改进Cre/loxP重组系统提供一种简便直观的检测方法.在用二次转化法稳定表达Cre重组酶消除转基因植物中选择标记基因的研究中,利用绿色荧光蛋白(GFP)活体检测的优点,构建了植物表达载体pGNG.将绿色荧光蛋白基因(rfp)和卡那霉素抗性基因表达盒(NosP-nptⅡ-NosT)一起克隆在两个同向的loxP位点之间,在第一个loxP位点上游置有花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子以驱动GFP表达,第二个loxP位点下游置有不含启动子的大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶基因(gus).首先在含卡那霉素(Kan)的培养基上筛选出转pGNG的烟草,借助绿色荧光可方便地挑选出表达GFP的转化体,并通过PCR、Western blot等分子生物学手段进一步验证.然后用另一转化载体pCambia1300-Cre二次转化表达GFP的转基因植物,利用另一选择标记基因—潮霉素抗性基因(hpt)进行筛选,在获得的再生植株中,Cre重组酶的表达消除了转化体中两个loxP位点间的gfp和nptⅡ.实验结果表明可借助GFP荧光的消失,快速选出nptⅡ被消除的二次转化体,同时GUS(作为目的蛋白)在CaMV 35S启动子驱动下获得表达.然后利用后代的分离将hpt和cre除去.最后尝试了一种采用植物病毒载体瞬间表达Cre酶用以高效消除转基因植物中的选择标记基因的方法.