该文在对现有技术进行深入研究的基础上,主要围绕三维光学显微术的纵向分辨能力展开了以下几个方面的研究工作:1.自行搭建了一套反射式激光共焦扫描实验系统,包括硬件系统的建立、控制软件以及图像重构软件系统的编制,对激光器、成像镜头等器件进行了分析和选择,并给出了利用该系统获得的实验结果和层析图像.2.针对探测针孔为有限大小的情况,进行了利用两区位相型滤波器提高共焦系统纵向分辨率的研究.首先在理论上讨论了针孔大小对滤波器性能的影响;然后,在实验上采用一透射式液晶空间光调制器实现了对共焦系统照明光场位相分布的动态调制,测量了不同大小探测针孔条件下,系统纵向分辨率随滤波器参数的变化情况,说明了利用合适的两区位相型滤波器可以提高采用有限大小探测器共焦显微系统的纵向分辨率.3.为减轻共焦针孔校准调节方面的困难,提出了一种采用虚拟针孔的新型共焦显微系统,该系统将CCD接收面直接置于探测光路中的焦平面位置,通过后期软件处理的方法加入一虚拟共焦针孔,有效地减弱了非焦平面产生的杂散光对成像质量的影响,并利用该成像系统进行成像测试实验.4.针对采用高数值孔径物镜的显微系统,从矢量衍射理论出发,进行了超分辨光瞳滤波器的研究,提出了两种用于提高系统纵向分辨率的光瞳滤波器:一种是分辨率可调的振幅型滤波器,另一种是光能利用率较高的二元位相型滤波器.最后,利用共焦显微系统点扩散函数的乘积特性大大减弱了旁瓣的强度.5.以活细胞为特定观测对象,通过分析折射率失配对分辨率、系统点扩散函数峰值强度、焦点漂移等参数的影响,讨论了高斯光束特性、共焦针孔、数值孔径在利用双光子荧光显微术观察活细胞的过程中对折射率失配的作用,研究结果将对在实际操作中获得高质量的活细胞层析图像起到有力的指导作用.