论文部分内容阅读
牛支原体(Mycoplasma bovis)是一种能够造成肉牛、奶牛以及犊牛多种疾病综合征的病原体。临床症状主要包括肺炎、乳腺炎、关节炎、脑膜炎、角膜结膜炎以及生殖器官疾病。牛支原体病在全世界范围内广泛存在,对乳制品以及肉制品行业造成了巨大的经济损失。牛支原体遗传操作技术的缺乏一直阻碍着对其致病机理的研究。转座子是目前能够用于牛支原体遗传操作有效工具,通过电穿孔方法将其导入牛支原体细胞可以造成基因的随机插入失活,为研究牛支原体基因功能和致病机制带来了曙光。本研究旨在使用转座子插入突变方法构建牛支原体08M株的突变体文库,为毒力相关基因的鉴定提供技术平台。首先确定08M株的浓度,用颜色变化单位(Color changing units,CCU)表示;测定庆大霉素(Gentamicin,Gm)对牛支原体的最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC),进而通过电穿孔方法将庆大霉素抗性质粒pISM2062(携带有转座子Tn4001mod)导入牛支原体08M株细胞内,经抗性平板筛选、液体培养及PCR鉴定,构建08M株的突变体文库。随机挑选10个突变株传代10次检测转座子稳定性,挑选2个突变株用Southern blotting检测转座子是否存在多次插入。设计合成了28对牛支原体可能的毒力相关基因的引物,使用大海捞针筛选法对突变体库进行初步筛选,旨在筛选出感兴趣基因的突变株。结果显示,复苏0 h的08M株的颜色变化单位为1.13×10~7 CCU/mL,庆大霉素MIC为16 ng/μL;电转化后涂抗性平板生长菌落445个,对380个培养成功的菌落进行PCR鉴定,结果显示存在Tn插入的菌株有263个,阳性率为69.21%(263/380);连续传代培养10代次后,PCR鉴定结果显示插入的转座子稳定传代;Southern测定结果显示转座子在传代过程中不存在二次及多次插入。使用大海捞针筛选没有从突变体文库中筛选出感兴趣基因的突变株。本研究成功构建了牛支原体08M株的突变体库,转座子稳定存在,不存在二次及多次插入。使用大海捞针筛选没有从突变体文库中筛选出感兴趣基因的突变株。