近年来中国内地育龄夫妇不孕不育症发病呈上升趋势。美国流行病学调查显示，育龄夫妇不孕不育患病率约为10-12%，发展中国家育龄期夫妇中约达10-15%，其中男性因素造成的不育占30%。这不仅严重困扰育龄夫妇及其家庭的和谐生活，也给国家和社会带来沉重的负担。但是，不孕不育的发生病因复杂，其发病机理目前尚不明确。因此，深入研究不孕不育的发生、发展机制，探索预防和治疗不孕不育的新途径，不仅具有重要的科学价值，而且具有潜在的临床应用前景和社会效益。本课题组实验发现βB2-晶体蛋白（Crybb2）基因敲除（Knock out，KO或Crybb2-/-）的雄性小鼠生殖能力明显下降，其影响后果远远超出了一种非生殖功能相关基因被敲除后的结果，推测βB2-晶体蛋白有可能是一种重要的、尚未被报道的生殖功能相关的调控基因。由此引出的问题是：该蛋白通过何种机制对雄性小鼠的生殖功能起到调控作用？主要的影响因素有哪些？促进βB2-晶体蛋白体内表达能否有助于改善生殖功能等，即为本课题的研究目的。晶体蛋白是哺乳动物晶状体细胞质中主要的结构蛋白，根据其在电场中的迁移能力要分为α、β、γ三大类。目前对于α晶体蛋白的特性及生物学作用机理已有较深入的研究，其中最重要一点是α晶体蛋白可以通过与错误折叠或变性的蛋白质结合发挥分子伴娘功能，从而阻止其非特异性聚集，维持晶状体的透明性；然而对β族晶体蛋白的生物学特性及其功能还所知较少，在β族晶体蛋白中，βB2-晶体蛋白含量最高，而且它的水溶性成分呈反常年龄依赖性增高，其正常结构及其水溶性成分水平对维持晶状体的高折射系数和透明至关重要。前期研究表明，βB2-晶体蛋白的结构和功能均极为特殊，除了高表达于晶状体内、对维持晶状体的透明等正常生物学特性至关重要外，在晶状体外的多个组织器官如睾丸、脑、视网膜等也存在较高水平的表达，并发挥着重要的生物学功能。新近研究表明，βB2-晶体蛋白基因突变小鼠的生殖功能发生显著下降，然而具体机制不明。本课题组在前期研究βB2-晶体蛋白在晶状体混浊发生发展中的作用及功能时，成功构建了βB2-晶体蛋白基因敲除小鼠模型，在研究及饲养小鼠过程中发现，对比正常野生型（Wild type，WT）小鼠，该基因敲除的雄性小鼠生殖功能明显下降。为探讨其原因，本课题拟在前期研究基础上，进一步观察并研究βB2-晶体蛋白基因敲除后对雄性小鼠生殖功能的影响，深入探讨βB2-晶体蛋白调控雄性生殖的作用机制，以期对临床探究不育症的发病机理提供新的思路和途径。研究目的：观察βB2-晶体蛋白基因敲除后雄性小鼠生殖功能的改变，分析βB2-晶体蛋白在维持雄性小鼠正常生殖功能方面的作用，重点探讨βB2-晶体蛋白调控雄性小鼠生殖功能的机制所在，以期对临床不育病人发病机理的研究提供新的思路和实验数据。研究方法：1. βB2-晶体蛋白基因敲除小鼠模型的建立及鉴定实验前，剪取鼠尾末端组织，抽提基因组DNA，通过PCR扩增技术及琼脂糖凝胶电泳分析方法对实验小鼠的基因型进行鉴定。取小鼠眼晶状体进行匀浆离心后取上清液，通过Western blot技术对晶体蛋白的表达进行鉴定。2.明确βB2-晶体蛋白在小鼠睾丸组织内的表达分别采用Real time PCR和Western blot方法验证βB2-晶体蛋白在正常野生型小鼠的睾丸内存在表达，而在基因敲除小鼠的睾丸内不存在表达；进一步采用免疫荧光组织化学染色方法明确βB2-晶体蛋白在正常小鼠睾丸组织内的定位。3.观察βB2-晶体蛋白基因敲除对雄性小鼠生殖功能的影响分别将性成熟（8周龄）的正常野生型雌性小鼠与正常野生型雄性小鼠、基因敲除型雄性小鼠配对，各5对并分笼饲养，观察一段时间内两者生产窝数及每窝产仔数等的差别；计数基因敲除小鼠的精子数目及精子活性；连续观察雄性小鼠出生后数周内睾丸组织发育情况，同时病理HE染色分析睾丸组织病理学的改变。4.睾丸组织生殖细胞增殖和凋亡检测分别采用BrdU增殖检测、TUNEL原位凋亡及流式细胞术检测凋亡等的方法，检测βB2-晶体蛋白基因敲除后小鼠睾丸组织内生殖细胞增殖、凋亡等的改变，分析精子计数减少的可能原因。5.生殖及凋亡相关蛋白的检测采用Real time PCR和Western blot方法检测CaMKIV、Crem、Tsg23、Cklfsf2b、Bax以及Bcl-2等与生殖和增殖、凋亡等相关的基因及其蛋白在KO小鼠睾丸组织内表达量的改变。6.小鼠血清睾酮含量检测酶联免疫吸附法（ELISA）分别检测正常野生型及βB2-晶体蛋白基因敲除型小鼠血清睾酮含量，分析是否由于睾酮含量的改变引起雄性小鼠精子计数等生殖功能的改变。实验结果：1.实验小鼠基因型及蛋白鉴定结果经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳分析，成功检测了实验小鼠的两种基因型，纯合的KO小鼠和纯合的WT小鼠。经Western blot鉴定，纯合小鼠晶体蛋白未检测到βB2-晶体蛋白的表达，野生型小鼠晶体蛋白在分子量23KD处检测到该蛋白的表达。2. βB2-晶体蛋白在睾丸组织中的表达Real time PCR及Western blot方法分别检测到βB2-晶体蛋白基因及其蛋白在野生型小鼠睾丸组织内的表达，而在KO小鼠睾丸内检测不到βB2-晶体蛋白的表达；免疫荧光组织化学染色结果进一步显示βB2-晶体蛋白主要定位于小鼠睾丸组织的精原细胞内。3. βB2-晶体蛋白基因敲除对雄性小鼠生殖功能的影响相同生产周期内，相对正常野生型配对小鼠，与KO雄鼠配对的雌性小鼠生产窝数及每窝的生仔数均明显减少，性成熟的KO雄性小鼠精子计数减少，KO小鼠4周龄时睾丸组织明显增生，而睾丸生精小管变细、并且稀疏。4.睾丸生殖细胞增殖、凋亡均显著增加BrdU增殖和TUNEL原位凋亡及流式细胞凋亡检测结果显示，相对正常小鼠，基因敲除小鼠的睾丸组织内精原细胞的增殖和凋亡显著增加。5.小鼠睾丸组织内相关蛋白表达量的改变采用Real time PCR和Western blot方法检测了小鼠睾丸内CaMKIV、Crem、Tsg23、Cklfsf2b、Bax和Bcl-2等生精和增殖、凋亡等相关蛋白的表达，结果显示KO小鼠睾丸内CaMKIV和Bcl-2的mRNA及蛋白水平均显著降低；Bax的蛋白表达量增加，mRNA表达呈现增多趋势，但不具有统计学意义；Crem、Tsg23及Cklfsf2b等表达量未见明显改变。6. KO小鼠血清睾酮含量降低ELISA方法检测结果显示，相对正常野生型小鼠，基因敲除小鼠的血清睾酮含量明显降低。实验结论：1． βB2-晶体蛋白在晶状体外组织-睾丸内也存在较高水平的表达。2． βB2-晶体蛋白基因敲除后雄性小鼠生殖功能显著下降。3. βB2-晶体蛋白基因敲除后，小鼠睾丸内CaMKIV表达量显著降低，进而导致其下游蛋白Bcl-2表达减少，引起了睾丸精原细胞的过度增殖和凋亡，生殖细胞增殖和凋亡的紊乱使得小鼠生精功能发生障碍；同时该基因敲除也使血清睾酮含量明显降低，使小鼠生殖系统受损、精子发生障碍。