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目的:观察松花粉提取物对实验性肝纤维化的防治作用效果,并分别通过体内和体外实验的检测结果探讨其作用途径和机制,为科学合理地开发松花粉资源以及寻找安全、有效、经济、便捷的肝纤维化营养支持制剂的功效成分提供实验依据。方法:实验研究分为三部分第一部分对松花粉原粉(MPPOP)、松花粉水提物(MPPAE)及松花粉醇提物(MPPEE)进行营养成分分析,包括粗蛋白、粗脂肪、粗纤维等主要营养素含量、9种矿物质和微量元素含量、18种氨基酸的含量以及几种主要维生素的含量,观察其营养成分特点,为分析其生理功效及作用机制打下基础。第二部分通过体外细胞培养方法,用CCl4制备正常人肝细胞系L-02的氧化损伤模型,同时给予不同浓度的MPPAE进行干预,观察其对肝细胞损伤后的形态、增殖活性及细胞功能的影响作用,并用肝细胞损伤条件培养液刺激人星状细胞系LX-2活化模型,同时给予不同浓度MPPAE干预,观察其对LX-2细胞活化的抑制作用效果及作用途径。第三部分用腹腔注射CCL4的方法制备实验性肝纤维化大鼠模型,同时分别灌胃不同浓度的MPPAE,并与MPPOP的作用效果进行比较,观察其对实验性肝纤维化动物模型的体内作用效果及主要作用途径。结果： 1.松花粉及其提取物营养成分分析结果显示:⑴.松花粉中碳水化合物和粗纤维含量最为丰富,由于粗纤维的不溶性,经提取后大部分被除去,两种提取物中的含量均显著下降;碳水化合物在醇提物中明显富集,粗蛋白含量则在水提物中有所提高;由于蛋白质多为水溶性,醇提物中蛋白质几乎全部丢失;⑵.松花粉中含有丰富的矿物质及微量元素营养成分,尤以钾、钙、磷、镁元素为多,除铁元素外MPPAE中的元素含量均比MPPOP提高1.6-3.5倍,醇提物则显著降低1.7-13.4倍;⑶.松花粉中含有人体所需的全部必需氨基酸,其中支链氨基酸和甘氨酸、精氨酸等具有免疫活性的氨基酸含量丰富,MPPAE中的含量更达到MPPOP的2.0-12.8倍,非常符合慢性肝病患者的营养需求特点,醇提物中的氨基酸含量则降低1.1-115.4倍;⑷.松花粉中总多酚以及总黄酮含量分别达到380 mg/100g和364mg/100g,MPPAE中的总多酚高达MPPOP的5.2倍,抗氧化活性增强可能正是其发挥抗纤维化作用的物质基础之一;⑸.MPPOP中含有多种维生素,但经过提取过程MPPAE中大部分维生素都损失掉了,MPPEE中酯溶性维生素A得到富集,含量提高约100倍,其它维生素含量极低。2.MPPAE对体外细胞损伤模型的作用效果观察发现:⑴.MPPAE对CCl4损伤L-02细胞增殖活性的保护作用不明显,但对CCl4导致的肝细胞形态和脂肪性变有明显改善效果;⑵.CCl4损伤L-02细胞后上清液的转氨酶ALT、AST活性均有升高,MPPAE干预对转氨酶的变化具有抑制作用,且具有量效关系;⑶.CCl4损伤L-02细胞后上清液的SOD活性及MDA含量均极显著升高,分别达正常组的3.90倍和6.51倍,主要原因是细胞损伤后的氧化应激反应引起SOD代偿性增高,同时肝细胞的氧化损伤产生大量脂质过氧化物,MPPAE能够有效抑制SOD和MDA的异常升高,MDA含量的降幅达到34.8-87.5%,SOD活性最高降幅达68.4%,并具有良好的浓度效应关系,可能与其多酚类化合物含量丰富有关;⑷.L-02条件培养液在适当剂量能够刺激LX-2细胞活化增殖,MPPAE的干预可以有效抑制其增殖活性,并促进活化的LX-2细胞凋亡,从而减少ECM生成,抑制纤维化进程;⑸.L-02条件培养液刺激LX-2细胞活化后上清液中I型和III型胶原蛋白含量略有升高,基质金属蛋白酶MMP-1和MMP-2表达量没有明显变化,TIMP-1的表达量则显著升高85.2%;MPPAE的干预具有降低胶原含量,上调MMP-1和MMP-2表达量的趋势,而对TIMP-1的异常高表达则发挥了明显调节作用,表明MPPAE是通过下调TIMP-1表达量,减少其对MMPs的抑制作用,间接增强ECM的分解代谢,发挥调节I、III型胶原蛋白含量的作用。3.MPPAE及MPPOP在CCl4致大鼠实验性肝纤维化模型的体内实验观察发现:⑴.CCl4腹腔注射8周制作大鼠实验性肝纤维化模型是成功的;⑵.MPPAE的干预能够有效缓解模型大鼠实验性肝纤维化的症状,在生长发育、腹水形成和肝细胞形态病变等方面都有良好改善作用,胶原纤维染色显示胶原面积由20.14%下降到8.23%;⑶.肝纤维化模型大鼠肝功转氨酶ALT、AST活性较正常组分别升高6.86倍和4.42倍,APPAE干预可显著抑制其异常,高剂量组可使其下降64.3%和58.1%。⑷.肝纤维化模型大鼠血清和肝组织中的纤维蛋白和胶原含量显著升高,其中血清透明质酸(HA)和肝脏羟脯氨酸含量分别升高1.85倍和1.81倍,MPPAE的干预可使其降低23.7%和23.2%;⑸.CCl4损伤后大鼠肝脏SOD活性无显著变化,MDA含量略有升高,GSH-Px活性则显著下降36.0%,MPPAE可以显著提高SOD及GSH-Px活性,GSH-Px水平可提高23.3%,并有效降低过氧化产物在体内的蓄积;⑹.MPPAE能够调节模型动物体内多种纤维化相关因子如肿瘤坏死因子-β1(TGF-β1)、血小板源性生长因子(PDGF)、核转录因子-κB(NF-κB)m RNA的异常高表达,抑制星状细胞(HSC)的进一步活化,从而控制胶原生成,同时促进基质金属蛋白酶(MMPs)的表达以促进胞外基质(ECM)降解。⑺.多项检测结果均显示,MPPAE对肝脏的保护作用和抑制纤维化发生发展的效果优于松花粉原粉,更适合应用于慢性肝病患者的临床营养支持。结论:MPPAE中营养成分种类齐全,含量丰富,在体外和体内实验观察中均发挥出抑制细胞及模型动物实验性肝纤维化进程的功效,有效改善肝细胞状态和功能,其机制主要是通过提高抗氧化能力,抑制过氧化物蓄积,调节纤维化相关因子和蛋白的表达,促进活化HSC凋亡等多条途径发挥作用,效果优于松花粉原粉,是一种比较理想的抗肝纤维化营养补充剂的功效成分。