ChABC缓释微球促大鼠损伤脊髓再生修复的实验研究

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目的:①制备ChABC缓释微球,考察其外观形态、粒径分布、载药量、包封率及体外释药特性以用于进一步的大鼠脊髓损伤动物实验研究。②探讨ChABC缓释微球促进大鼠损伤脊髓再生修复的作用。方法:①通过复乳法制备ChABC缓释微球,使用扫描电镜及激光粒度分布仪观察微球形态并测定其粒径分布;考察微球载药量、包封率等指标;并以生理盐水作为体外降解介质,采用酶活性测定方法初步研究ChABC缓释微球体外释药特性。②采用大鼠T10脊髓完全横断伤模型,将大鼠分为正常组(N)、假手术组(S)、单纯损伤组(L)、ChABC单剂组(C)、ChABC缓释微球组(M)。N组:不进行任何干预处理;S组:只咬除T8~9椎板,不损伤脊髓;L组:脊髓横断后,断端局部使用生理盐水;C组:脊髓横断后,断端局部使用ChABC;M组:脊髓横断后,断端局部使用ChABC缓释微球。于大鼠脊髓损伤术后每周行BBB运动功能评分。损伤后4w,每组行CS56免疫组化染色,损伤后10w,每组行TMRDA顺行示踪,CSEP诱发电位检查,及NF200、GAP43、GFAP免疫组化检查,并采用免疫组化图像分析系统进行定量分析。结果:①采用复乳法制备的ChABC的PLGA缓释微球,其表面光滑圆整,颗粒规则无粘连,微球大小较均匀,粒径分布较窄;微球的平均载药量为15.55±0.90%,平均包封率为53.88±1.45;微球冷冻干燥后,再分散性良好,外形美观;微球体外释药研究表明,载药微球在3w内的累积释药分数为0.8514,释药过程较为平稳,其体外释药符合Weibull方程并能达到有效的治疗浓度。②BBB运动功能评分:术后10w,三组比较具有统计学差异;两两比较,M组与L组、C组与M组具有统计学差异。③CSEP诱发电位检查:正常组大鼠CSEP检测,主反应潜伏期为14.76±1.454ms、主反应峰峰值为0.200±0.0318mv。M组主反应潜伏期为25.53±2.215ms、、主反应峰峰值为0.028±0.003mv,两组差异有统计学意义。其它各组均未检测出CSEP波型。④脊髓标本一般观察:术后10w取材及HE染色,见各组脊髓横断处断端均已连接,但瘢痕范围及色泽不同,脊髓横断处大量胶质细胞浸润。⑤TMRDA顺行示踪:各组的荧光含量、强度、形态分布具有不同特点:正常组大鼠及各脊髓损伤组大鼠的脊髓横断伤头侧可见与脊髓纵轴平行排列的大量强烈连续线状荧光;L组脊髓横断伤尾侧可见少量中等强度的点状荧光和稀疏微弱的间断线状荧光;C组脊髓横断伤尾侧可见中等量中等强度的点线状荧光和稀疏微弱的间断线状荧光;M组脊髓横断伤尾侧可见中等量中等强度的连续线状荧光。⑥免疫组化结果及图像分析显示:CS56染色:M组总阳性总面积大于C组,差异有统计学意义;NF200染色:M组总阳性面积大于L组,差异有统计学意义;GAP43染色:M组总阳性面积大于L组,差异有统计学意义;GFAP染色:L组、C组、M组之间差异无统计学意义。结论:①本实验采用复乳法,成功制备得到ChABC的PLGA缓释微球,制备的ChABC缓释微球各项指标达到预期要求,可用于进一步的ChABC促大鼠损伤脊髓再生修复的实验研究。②ChABC缓释微球能促进脊髓损伤大鼠的运动功能恢复、神经束路的解剖再生及神经传导功能的恢复,其效果优于ChABC。③ChABC缓释微球能在损伤处持续酶解CSPGs,减少局部CSPGs的含量,其效果优于ChABC。④ChABC缓释微球能提高脊髓损伤局部NF200、GAP43的表达水平,显示局部脊髓再生修复加强,其效果优于ChABC。
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