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研究背景：胃癌是源于胃上皮细胞的严重危害人类健康的恶性肿瘤之一,在我国,胃癌有着高发病率和致死率。因此,揭示胃癌发生机制,发现关键的肿瘤标志物,进而针对特异性的肿瘤标志物进行干预和调控,是防治胃癌的重要策略。特异性microRNA (miRNA)表达异常可能是导致胃癌的重要机制之一,miRNAs通常在转录后水平调控基因表达,广泛参与细胞增殖、凋亡、发育分化等过程,并与包括肿瘤在内的多种人类重大疾病的发生密切相关。因此miRNAs已成为肿瘤研究领域的热点之一,验证肿瘤中异常表达的miRNAs所调控的靶基因,明确miRNAs在肿瘤发生中的作用机制,进而评估特定miRNAs在肿瘤治疗中的应用价值意义重大研究目的：本文利用miRNAs微阵列芯片筛选出在胃癌中显著低表达的miR-320a,又通过全基因组芯片和在线数据库预测出其下游靶标Forkhead box M1(FoxM1)及FoxM1的下游分子P27KIP1,研究miR-320a通过靶向调控FoxM1-P27KIP1通路抑制胃癌发生发展的作用,并探讨其相关机制。实验方法：1人胃癌组织样本研究从山东大学齐鲁医院获得胃癌病人的胃癌组织和正常癌旁组织22对,利用免疫组化和实时定量PCR检测miR-320a和FoxM1的表达,并通过对比确定两者的相关性。2体外实验研究2.1利用miR-320a的mimics和inhibitor分别转染胃癌细胞系AGS、BGC-823、 HGC,检测转染前后miR-320a的变化对FoxM1、P27KIP1的蛋白及mRNA表达的影响；2.2转染miR-320a的mimics和inhibitor后,检测胃癌细胞系AGS、BGC-823、 HGC的克隆形成数的变化；2.3在FoxM1的3’UTR包含miR-320a的靶向结合序列,构建FoxM1的3’UTR质粒和3’UTR突变质粒,通过双荧光素酶实验检测转染miR-320amimics和3’UTR质粒/突变质粒的胃癌细胞荧光素酶活性变化；2.4通过回复实验检测转染niR-320a inhibitor和FoxM1的小干扰RNA后,FoxM1和P27KIP1的蛋白及mRNA表达变化以及克隆形成数的变化。3体内实验研究选取8-10周龄裸鼠,皮下注射miR-320a稳定干扰的BGC-823,稳定生长一周后,每5天测量一次肿瘤体积并实时监测肿瘤生长情况,27天后处死并取瘤组织,利用免疫组化和实时定量PCR检测FoxM1和P27KIP1的表达变化。实验结果：1 MiR-320a在人胃癌组织中表达降低,与FoxM1的表达呈负相关关系。1.1提取胃癌与癌旁组织RNA进行qRT-PCR,检测发现与癌旁组织相比,miR-320a在胃癌组织中低表达(*P<0.05),FoxM1 mRNA在胃癌组织中高表达(*P<0.05)1.2对胃癌中miR-320与FoxM1 mRNA的表达做回归分析,发现miR-320a与FoxM1的表达呈负相关关系。1.3对临床病历资料进行分析,发现miR-320a与FoxMl mRNA的表达与病人年龄、性别、肿瘤分化状态无关。1.4对胃癌与癌旁组织切片做免疫组化,发现在胃癌中随着FoxM1蛋白表达升高(**P<0.01),P27KIP1蛋白表达下降(**P<0.01)2 MiR-320a负调控FoxMl的表达,正调控P27KIP1的表达,且miR-320a可以直接结合到FoxMl的3’UTR区。2.1在胃癌细胞系AGS、BGC-823、HGC中,转染miR-320a mimics可在mRNA和蛋白水平降低FoxM1的表达(*P<0.05),恢复P27KIP1的表达(*P<0.05)；而转染miR-320a inhibitor则可在mRNA和蛋白水平升高FoxM1的表达(*P<0.05),降低P27K1P1的表达(*P<0.05)2.2 MiR-320a受抑制可以提高FoxM1的蛋白水平(‘P<0.05),降低P27K1P1的蛋白水平(*P<0.05),并且miR-320a对这两种蛋白水平的影响大于FoxM1 siRNA对这两种蛋白水平的影响。2.3在胃癌细胞系AGS、BGC-823、HGC中,共转染miR-320a mimics和FoxM1野生型3’UTR质粒后,双荧光素酶活性与对照组相比减少了62%左右(‘P<0.05),而共转染miR-320a mimics和FoxM1突变型3’UTR质粒后,双荧光素酶活性与对照组相比无明显变化。3 MiR-320a可调控胃癌细胞增殖。3.1在胃癌细胞系AGS、BGC-823、HGC中,转染miR-320a mimics使胃癌细胞克隆形成数减少(**P<0.01),转染miR-320a inhibitor使胃癌细胞克隆形成数有所增多(**P<0.01)3.2转染miR-320a inhibitor使胃癌细胞克隆形成数有所增多(**P<0.01),并且miR-320a inhibitor对克隆数的影响大于FoxM1 siRNA对克隆数的影响。3.3 MiR-320a基因受抑制可以加快裸鼠体内肿瘤生长速度。3.4 MiR-320a基因沉默能在mRNA和蛋白水平升高FoxM1的表达(**P<0.01),降低P27KIP1的表达(”P<0.01)实验结论：1 MiR-320a在人胃癌组织中低表达,FoxM1在人胃癌组织中高表达,两者呈负相关关系。2 MiR-320a直接作用于FoxM1的3’UTR区,抑制FoxM1的表达。3 MiR-320a通过FoxM1-P27KIP1调控胃癌细胞增殖。总而言之,miR-320a可与FoxM1 3’UTR的一段基序结合,抑制FoxM1的表达,并通过对FoxM1的抑制恢复P27KIP1的活性,最终抑制胃癌细胞增殖,提示miR-320a可能是一个潜在的胃癌治疗靶点,为胃癌的诊断、防治和预后提供了新思路。