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目的:世界范围内,肺癌在最近几十年中逐渐成为发病率最高的肿瘤。世界卫生组织调查发现,在2008年全世界被诊断为肺癌的人数为1.61亿人,占癌症总发病人数的13%,居第一位,在世界范围内男性肺癌发病率为女性的2.5倍。亚洲地区肺癌的发病率男性为32.4人/10万,在所有男性肿瘤的发病率中占第一位,女性为22.3人/10万。近50年来全球男性发病率增加10-30倍,女性增加3-8倍。从我国近年来城乡前10位恶性肿瘤构成来看,肺癌已代替肝癌成为我国首位恶性肿瘤死亡原因,占全部恶性肿瘤死亡的22.7%,且发病率和死亡率仍在继续迅速上升。目前我国肺癌发病率每年增长26.9%,如不及时采取有效控制措施,预计到2025年,我国肺癌病人将达到100万,成为世界第一肺癌大国。现在研究公认导致肺癌的主要原因为吸烟、遗传易感性、大气污染和环境致癌物暴露等。有资料表明长期吸烟者肺癌的发生率是非吸烟者的10倍到20倍。随着世界工业化步伐的加快,特别是发展中国家快速的工业化发展,环境污染也在加剧,石棉,重金属,多环芳烃(PAHs)类化合物,电离辐射的暴露等都是造成肺癌增加的原因。苯并(a)芘(benzo(a)pyrene,B(a)P)是广泛存在的一种多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbon,PAH)类环境致癌物,与人类肺癌发生密切相关。它不仅是多环芳烃类化合物中毒性最大的一种(其毒性超过黄曲霉毒素),而且也是所占比例较大的一种,但B(a)P是间接致癌物,经细胞微粒体中的混合功能氧化酶代谢激活后生成活性代谢终产物才具有致癌性。其中7,8-二氢二羟-9,10-环氧化苯并(a)芘(anti-benzo(a)pyrene-trans-7,8-diol-9,10-epoxide,anti-BPDE)的致癌性最强,它通过使DNA碱基突变来改变癌基因和(或)抑癌基因的表达和功能,它还可以影响细胞代谢和细胞周期的进行,从而使细胞恶性转化,诱发肿瘤。DNA测序技术的发展表明人类基因组中编码蛋白的基因不到2%,也就是说,超过98%的基因是不编码蛋白的,它们缺乏开放性阅读框,称作非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)。ncRNA从长度上划分可以分为两大类:短片段非编码RNA(short ncRNA)和长片段非编码RNA(long ncRNAs,lncRNA)。lncRNA是长度大于200nt,甚至达到100kb的一类非编码RNA。越来越多的研究表明lncRNA与多种肿瘤的生物学过程有关,在肿瘤的发生,发展过程中发挥着抑癌或促癌的作用。lncRNA在致癌过程中起到至关重要的作用,尽管有许多lncRNA已被发现,但lncRNA的致癌机制及其生物学意义尚不完全清楚。本实验室已有研究表明小分子非编码RNA(microRNA)与anti-BPDE诱导的人支气管上皮细胞(16HBE)的恶性转化有关,因而我们想进一步了解 lncRNA与anti-BPDE诱导的肺癌的关系。我们在本实验室构建的anti-BPDE诱导的16HBE恶性转化细胞(16HBE-T)中发现了一些异常表达的lncRNA。其中lncRNA-LOC728228在16HBE-T细胞中的表达明显上调,我们推测 LOC728228可能作为癌基因在肺癌的发生发展中发挥着重要的作用。一系列体内试验和体外试验结果表明,LOC728228可以通过促进细胞周期进程来促进恶性转化细胞的增殖,并增加了细胞的恶性程度。本研究揭示了lncRNA-LOC728228在 anti-BPDE诱导的肺癌的发生发展中发挥着重要的作用,并为 lncRNA与化学物致癌的研究提供了新的视野。 方法:⑴筛选差异表达的基因对lncRNA差异表达谱进行分析,以差异表达大于2倍或小于0.5倍的标准对差异表达的基因进行筛选。用SAM(Significance Analysis of Microarrays)软件分析差异表达的基因,FDR小于5%,再以差异表达大于2倍或小于0.5倍的标准筛选差异表达的基因。⑵验证差异表达基因水平用SYBR Green染料法对差异表达基因进行qRT-PCR相对定量检测。⑶瞬时RNA干扰按照说明书的转染步骤用Lipofectamine-2000将siRNA转入16HBE-T和A549细胞。siRNA干扰效果用qRT-PCR进行相对定量检测,筛选效果最好的两对序列及最佳的siRNA转染浓度。⑷细胞增殖试验将细胞接种于96孔板,每孔3×103个,24h后进行siRNA的转染,然后分别在24h、48h和72h后用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力。⑸细胞周期检测将细胞接种于6孔板,用无抗生素培养基培养细胞,24h后转染siRNA,48h后收集并固定细胞,过夜然后用 PI染色,于流式细胞仪中检测细胞周期分布情况。⑹细胞凋亡检测将细胞接种于6孔板,用无抗生素培养基培养24h,转染siRNA,48h后收集细胞,按试剂盒说明书用Annexin V-FITC对细胞进行处理后,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。⑺稳定 RNA干扰将细胞接种于6孔板培养24h后,加入慢病毒液与Polybrene及培养基的混合液,进行正常培养,传代后加入5μg/ml嘌呤霉素筛选转染细胞,并观察荧光表达情况,shRNA干扰效果用qRT-PCR进行相对定量检测。⑻平板克隆试验把对数生长期的稳定转染细胞胰酶消化后制成单个细胞悬液,按每孔500个接种于6孔板中,培养两周后肉眼观察可见克隆形成后终止培养。用0.1%结晶紫染色后,对克隆进行计数,计算克隆形成率。⑼细胞划痕试验将稳定转染的细胞接种于6孔板,培养24h后,细胞汇合度为100%,用吸头垂直于平板划线,冲洗脱落的细胞,37℃无血清培养,在0h和24h分别于显微镜下拍照,并计算细胞迁移面积。⑽细胞迁移试验稳定转染的细胞无血清培养24h,用胰酶消化后重悬,并调整细胞密度,以每孔4×105个细胞的密度将细胞接种于Transwell24孔板的上室,24h后对迁移的细胞进行固定染色,用33%醋酸洗脱染色的细胞后用酶标仪测洗脱液在570nm波长处的吸光度。⑾裸鼠成瘤试验胰酶消化稳定转染细胞,用 PBS洗涤细胞两遍并重悬,将200μl约含106个细胞的细胞悬液注射于4周龄的BALB/c裸鼠腹股沟皮下。观察其成瘤情况,成瘤后每隔2天测量肿瘤长径和短径,20天后脱臼处死,取出肿瘤拍照并测量称重。⑿统计学分析所有试验至少重复3次,数据采用SPSS13.0进行统计分析,试验数据以x?s表示。两组间比较采用双侧Student’s t检验,3组以上比较用单因素方差分析,双侧检验以P<0.05为差异有统计学意义。 结果:①芯片结果与16HBE-N细胞比较,lncRNA LOC728228在16HBE-T细胞中表达上调3.17倍(Q<0.05)。②芯片结果验证及目的基因在其它肺癌细胞株的表达 LOC728228在16HBE-T细胞中的表达水平显著高于在16HBE-N细胞中的表达,是16HBE-N细胞的(3.19±0.19)倍(P<0.01)。LOC728228在肺癌细胞株A549细胞中的表达水平也上调,是16HBE-N细胞的(8.41±0.58)倍(P<0.01)。③用siRNA干扰目的基因的表达分别用4对siRNA序列转染16HBE-T和A549细胞,48h后发现siRNA-1和siRNA-2的干扰效率较好,都在70%以上,与siRNA-NC组和未转染组相比差别均具有统计学意义(P<0.01)。siRNA的最佳使用浓度为50nmol/l,干扰效率在70%以上,与siRNA-NC组和未转染组相比差异均具有统计学意义(P<0.01)。④细胞增殖能力改变在16HBE-T和A549细胞中转染siRNA,细胞增殖明显受到抑制。48h后siRNA-1和siRNA-2组细胞活性分别为:16HBE-T:(0.50±0.07)和(0.28±0.06),A549:(0.83±0.03)和(0.77±0.07),72h后细胞活性分别为:16HBE-T:(0.86±0.12)和(0.61±0.02),A549:(1.09±0.11)和(0.94±0.04),与siRNA-NC组和未转染组相比差异均具有统计学意义(P<0.05)。⑤细胞周期改变在16HBE-T和A549细胞中转染siRNA48h后,siRNA-2组细胞周期出现 G0/G1期阻滞,16HBE-T中,G0/G1期细胞从63.67%增加到77.46%,与siRNA-NC组和未转染组相比差异均具有统计学意义(P<0.05)。A549中,G0/G1期细胞从74.91%增加到80.13%,与siRNA-NC组和未转染组相比差异均具有统计学意义(P<0.05)。⑥细胞凋亡率检测在16HBE-T和A549细胞中转染siRNA48h后,siRNA-1和siRNA-2组细胞凋亡率与siRNA-NC组和未转染组相比差别没有统计学意义(P>0.05)。⑦稳定转染在16HBE-T细胞中转染shRNA慢病毒载体构建稳定转染细胞,稳转细胞株构建成功后shRNA的干扰效率在70%以上,与shRNA-NC组和未转染组相比差异均具有统计学意义(P<0.01)。⑧平板克隆形成能力改变 shRNA-1和shRNA-2组细胞克隆形成率显著下降为(45.40%±2.43%)和(44.27%±3.14%),与shRNA-NC组和未转染组相比差异均具有统计学意义(P<0.01)。⑨细胞迁移能力改变对稳转细胞进行划痕处理后,shRNA-1和shRNA-2组细胞相对迁移面积分别降低为(65.05%±3.62%)和(64.78%±2.20%),与shRNA-NC组和未转染组相比差异均具有统计学意义(P<0.01)。对细胞进行Transwell处理后, shRNA-1和shRNA-2组细胞液在570nm波长处吸光度分别降低了(28.93%±2.43%)和(37.87%±4.56%),与shRNA-NC组和未转染组相比差异均具有统计学意义(P<0.05)。⑩体内肿瘤生长力改变 shRNA-1和shRNA-2组的裸鼠肿瘤重量分别为(1.13±0.23)g和(0.92±0.29)g,肿瘤体积分别为(605.42±98.03)mm3和(493.38±65.36)mm3,均明显低于 shRNA-NC组和未转染组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。 结论:⑴在anti-BPDE诱导的人支气管上皮恶性转化细胞16HBE-T及肺癌细胞A549中lncRNA-LOC728228的表达明显上调。⑵lncRNA-LOC728228可能通过引起16HBE-T和A549细胞周期G0/G1期分布改变而影响其增殖。⑶抑制lncRNA-LOC728228的表达水平可降低anti-BPDE诱导的恶变细胞的恶性程度,lncRNA-LOC728228具有类癌基因的作用。