目的:CAR-T细胞疗法作为肿瘤免疫治疗的一种有效方案,能特异性识别并结合肿瘤相关抗原,发挥抗肿瘤活性。CAR-T细胞疗法在血液系统肿瘤上已获得巨大成功,各类实体瘤上的应用也在不断的探索。目前全球已经有超过300多项CAR-T相关临床试验正在进行,在各类临床试验中,CAR的结构被尝试进行改进,以提高抗肿瘤活性和安全性。现已经有2种CD19 CAR-T已经被FDA（Food and Drug Administration,美国食品药品监督管理局）批准上市,而国内仍处于临床试验阶段。CAR-T细胞治疗在临床上的应用前景广泛,但CAR-T细胞制备过程复杂,价格高昂,限制了CAR-T细胞治疗的推广和应用。本研究尝试构建CD3特异性慢病毒载体,在体内针对CD3+T细胞群,表达CAR,产生效应性CAR-T细胞,从而极大简化了CAR-T体外生产流程,为CAR-T细胞的推广提供一种可能,同时也是通用型CAR-T细胞的一种解决方案。本研究构建了一种慢病毒载体模型,能特异性的结合携带有相应抗原的细胞,稳转并表达目的基因序列,是一种兼具灵活性和稳定性的基因编辑工具。方法:本研究通过对二代LV（lentiviral vector,慢病毒载体）三质粒体系中决定LV感染能力的假型化包膜蛋白质粒p-CMV-VSVG进行改造。首先寻找合适的酶切位点,切除VSVG片段,回收剩余的线性载体质粒片段p-CMV-VSVG（SalⅠ、BglⅡ）。然后合成含改造后的麻风病毒血凝素蛋白DNA序列的质粒,这种改造后的麻风病毒血凝素蛋白适用于LV假型化,并且不结合其天然配体CD46和SLAM（signaling lymphocyte activation molecule,淋巴细胞信号活化分子）的能力。设计合适的引物,在DNA序列后加入适当长度的linker片段（G4S）3,通过PCR获得线性DNA片段H-（G4S）3。利用实验室已有的含CD3特异性单链抗体DNA片段的质粒,设计合适的引物,通过PCR获得线性CD3特异性单链抗体DNA序列OKT3。上述各线性DNA片段前后都有20bp的同源序列。利用Overlap PCR技术将H-（G4S）3和OKT3连接,获得线性DNA片段H-（G4S）3-OKT3。最后利用同源重组技术,将线性载体质粒片段p-CMV-VSVG（SalⅠ、BglⅡ）和H-（G4S）3-OKT接合,获得质粒p-CMV-Hm O。测序验证无误后,利用二代LV三质粒包装体系,包装生产CD3特异性LV。CD3特异性LV分别感染不表达CD3的293T细胞和稳定表达CD3的Jurkat细胞,检测其特异性感染能力和表达情况。结果:本研究成功构建了新的LV包膜蛋白质粒p-CMV-Hm O,利用p-CMV-Hm O代替原有的包膜蛋白质粒p-CMV-VSVG,生产出能特异性的感染CD3+细胞的慢病毒载体,并能稳定表达载体质粒中的目的基因序列。结论:利用p-CMV-Hm O,我们能生产CD3特异性LV。CD3在体内绝大多数具有生物活性的T细胞中高表达。利用这种CD3特异性LV可以在体内直接感染CD3+的T细胞,并表达CAR。这样,体内形成的CAR-T细胞再利用CAR特异性靶向肿瘤相关抗原,产生抗肿瘤杀伤活性。本研究还验证了一种慢病毒载体模型,通过改造慢病毒载体的包膜质粒,LV能特异性的靶向表达相应抗原的细胞,稳转并表达目的基因序列,是一种兼具灵活性和稳定性的基因编辑工具。