紫花苜蓿(Medicago sativa)，是重要的豆科牧草。紫花苜蓿含有丰富的蛋白质，会使反刍动物产生胀气病。提高紫花苜蓿中原花青素的含量能有效地避免胀气病的产生。蒺藜苜蓿（Mdeicago truncatula）作为紫花苜蓿的近缘种，是豆科的模式植物，具备完整的Tnt1突变体库。花青素和原花青素，是重要的类黄酮化合物，具有帮助植物授粉、防御真菌和病原菌的侵袭及抗胁迫等作用。目前，蒺藜苜蓿类黄酮化合物的生物合成和调控的机制已经被大量研究，然而，还有一些未知因素尚待阐明。　　本研究对大量蒺藜苜蓿Tnt1插入突变体进行筛选，获得了一个茎叶缺乏花青素、种皮颜色变浅的突变体NF0791。通过对该Tnt1突变体插入位点的侧翼序列进行分析，发现该突变体中19个基因含有Tnt1插入。其中，突变体在11号基因位点插入时显示无花青素和原花青素的积累的表型，反之亦然。说明11号基因的插入与花青素和原花青素含量减少的表型直接相关联。该位点编码一个丙酮酸激酶，于是命名为MtPK1。为了排除是其它插入位点引起该突变体表型的可能，本文还筛选到了MtPK1的另一个突变体NF9763，除了茎部有少量花青素的积累，叶子近轴面和远轴面没有花青素的积累，且种皮的颜色明显变浅。MtPK1的两个突变体具有相同的表型，证明了花青素和原花青素减少的表型是由MtPK1的突变引起的。丙酮酸激酶是糖酵解过程的主要限速酶之一，不可逆地催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)将磷酸基团转移到ADP形成丙酮酸和ATP。PEP又能作为莽草酸途径的底物合成类黄酮途径的前提物质——苯丙氨酸。目前为止，还没有任何关于丙酮酸激酶参与类黄酮合成和/或调控的报道。　　本文为了研究丙酮酸激酶对类黄酮化合物的作用，对蒺藜苜蓿中花青素和原花青素的含量进行了定量分析，与野生型相比，突变体中花青素和原花青素的含量显著降低。同时，半定量RT-PCR实验表明，在突变体NF0791和NF9763的叶片中没有检测到MtPK1的表达。说明Tnt1的插入影响了MtPK1基因的转录，从而导致了蒺藜苜蓿中花青素和原花青素的减少。　　同源序列比对分析和结构域分析表明，MtPK1不仅具有保守的丙酮酸激酶活性结构域，在其N端和C端还分别存在一个β桶状结构域和一个α/β结构域。系统进化树分析表明MtPK1和蒺藜苜蓿其余的11个PK及拟南芥的16个PK和水稻的9个PK主要聚成两簇:胞质丙酮酸激酶(PKc)和质体丙酮酸激酶(PKp)，MtPK1与水稻的OsPK1(Os11g0148500)同属于PKc，说明它们可能具有相同的功能。为了证明MtPK1属于胞质丙酮酸激酶，在拟南芥原生质体中进行瞬时表达了MtPK1，结果表明MtPK1确实定位在细胞质中。为了进一步证明MtPK1的丙酮酸激酶特性，将MtPK1构建在原核表达载体pQE30上，利用大肠杆菌原核表达系统，诱导、提取并纯化出6×His-MtPK1重组蛋白。在以K+和Mg2+作为辅因子，NADH为还原力，PEP和ADP作为底物进行的体外酶活实验中，发现MtPK1具有胞质丙酮酸激酶的一般特性。结果还表明MtPK1的最适pH为6.4，对PEP和ADP的Km值分别是149μM和106μM。　　为了阐明MtPK1影响花青素和原花青素合成的机制，本研究对MtPK1的组织表达模式进行了荧光定量RT-PCR实验，结果表明MtPK1在蒺藜苜蓿的所有部位都表达，在根和24d种子里的表达水平最高。这与花青素和原花青素的合成部位相同，说明MtPK1可能参与种子中原花青素的合成。本文还对蒺藜苜蓿野生型R108、突变体NF0791和NF9763中参与花青素合成的相关关键基因的转录水平进行了检测，发现CHS、CHI、DFR1和DFR2的表达水平明显地被下调。说明突变体中花青素途径基因表达水平的改变引起了花青素含量的降低。为了进一步证明MtPK1能促进花青素的合成，将MtPK1基因的全长CDS序列在突变体NF0791和野生型蒺藜苜蓿中过表达，突变体基本恢复到了野生型的表型。证明了确实是Tnt1的插入引起MtPK1基因的突变，从而导致突变体的表型。此外，本文还利用HPLC的方法检测了野生型、突变体NF0791和NF9763地上部分果糖、葡萄糖和半乳糖的含量，发现三种单糖的含量没有显著变化，排除了这三种糖的改变造成花青素含量变化的可能。　　总之，本研究首次鉴定和分析了胞质丙酮酸激酶MtPK1在蒺藜苜蓿花青素和原花青素生物合成中的功能，为类黄酮化合物合成途径的研究奠定了基础。因此，可以通过转基因的方法将MtPK1转入到紫花苜蓿等豆科植物中，以达到作物品质改良的目的。