论文部分内容阅读
目的Involucrin是交联包膜的蛋白前体,其不仅作为表皮角质细胞早期分化的标记,同时也是鳞状上皮细胞终末分化的标记。研究表明,Involucrin在多种肿瘤呈现高表达状态,在肿瘤的诊断中发挥重要作用。然而其在肿瘤发生过程中的不同阶段的表达变化及相应的变化机制目前尚不清楚。本研究以低剂量亚砷酸钠长期染毒致永生化人角质形成细胞(Human Keratinocytes,Ha Ca T)恶性转化细胞模型为研究载体,检测此过程中Involucrin表达的动态变化,并以JNK/c-Jun信号通路为切入点探讨引起Involucrin表达变化的分子机制。方法1.建立低剂量亚砷酸钠致Ha Ca T细胞恶性转化模型:以Ha Ca T细胞为研究对象,常规培养24h后,再分别加入含有0.0、1.0μmol/L Na As O2的DMEM完全培养液连续培养直至35代(约18周)后,观察检测细胞恶性程度。2.细胞生长动力学x实验:分别收集传代对照和1.0μmol/L Na As O2染毒14、21、28和35代处于对数生长期细胞,接种相同数量细胞于二十四孔板中,每天计数,连续六天,最后计算细胞倍增时间。3.软琼脂克隆形成实验:将21、28、35代染毒组和传代对照组的Ha Ca T细胞分别与0.7%低熔点琼脂糖培养基等体积混合后,铺于含有0.7%低熔点琼脂糖的下层培养基上,凝固后,表面加入适量的DMEM完全培养液,37℃、5%CO2培养,每3d换一次液,培养过程中动态观察,3周后终止培养并停止计数。4.氧化应激指标的检测:收集染毒组处于生长对数期的0、1、7、14、21、28和35代Ha Ca T细胞,采用流式细胞仪检测不同代数Ha Ca T细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。5.Western blot检测蛋白的表达:收集染毒组和对照组处于生长对数期的0、1、7、14、21、28和35代Ha Ca T细胞,提取细胞总蛋白并测定其浓度,然后用SDS-PAGE分离蛋白,转膜,封闭,用特异性一抗孵育4℃过夜,结合二抗后,用化学发光法检测相关蛋白磷酸化水平及其表达情况。6.SP600125抑制JNK的表达:选取含有0.0、1.0μmol/L Na As O2的DMEM完全培养液连续培养的第35代Ha Ca T细胞,加入SP600125(JNK的特异性抑制剂)分别作用两天、五天后,检测相关蛋白磷酸化水平及表达改变情况及细胞恶性转化程度。结果1.低剂量Na As O2连续慢性处理致Ha Ca T细胞恶性转化:分别用含0.0、1.0μmol/L Na As O2的DMEM完全培养液连续培养Ha Ca T细胞18周,从28代开始MMP-9表达明显升高,细胞的迁徙、转移能力逐渐增强;且35代细胞形态明显改变,细胞生长速度加快,倍增时间显著缩短;与此同时,1.0μmol/L Na As O2染毒的Ha Ca T细胞能在软琼脂培养基上形成更多、更大的细胞集落,说明此时细胞具有恶性表型。2.低剂量Na As O2连续慢性处理致Ha Ca T细胞恶性转化过程中Involucrin及JNK/c-Jun通路变化情况:Western blot的结果发现,在染毒中后期(14代~35代)随着染毒细胞代数的增加,Involucrin的表达逐渐增加;ROS活性则在染毒初期(1代)明显升高,在随后的暴露过程中ROS水平呈现先下降后上升的趋势,14代达最高点之后ROS活性逐渐降低,在35代时活性明显低于对照细胞。在染毒中后期,p-JNK、c-Jun的表达水平逐渐升高,而Jun B、Jun D、JNK蛋白的表达没有明显的变化。结果提示Na As O2诱导产生ROS激活JNK/c-Jun的表达可能参与到Involucrin的表达升高中。3.JNK/c-Jun信号通路对低剂量Na As O2染毒致Ha Ca T细胞恶性转化后Involucrin表达的作用:选取含有0.0、1.0μmol/L Na As O2的DMEM完全培养液连续培养的第35代Ha Ca T细胞,分别加入SP600125(JNK的特异性的抑制剂)两天、五天后,JNK、p-JNK表达水平降低,成功的阻滞了JNK通路,而c-Jun表达水平也随之降低,同时Involucrin的表达水平明显降低,更重要的是我们的软琼脂克隆实验结果显示,细胞集落的数量减少且体积变小,提示细胞恶性程度也降低。结果提示JNK/c-Jun信号通路参与调控Na As O2致Ha Ca T细胞恶性转化过程中Involucrin的表达,同时也与细胞恶性转化的进展有关。结论低剂量Na As O2连续慢性染毒致Ha Ca T细胞恶性转化过程中,Involucrin蛋白的表达逐渐增加,JNK/c-Jun信号通路参与调控Involucrin蛋白的表达,抑制JNK活性能够减少恶性转化Ha Ca T细胞Involucrin蛋白的表达,进而降低其恶性程度。