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目的:Klotho蛋白基因作为一种抗衰老基因在1997年被发现,并参与抗氧化应激、抗凋亡等调节。目前主流观点认为其主要在肾脏表达,并在肾脏损伤中发挥肾脏保护作用。噻嗪类利尿剂在临床工作中常用于处理高血压和细胞外液容量超负荷等。它主要是通过阻断肾脏远曲小管(DCT)上噻嗪敏感的Na-Cl共转运体(rTSCI/NCC)来减少NaCl重吸收。有文献报道称噻嗪类利尿剂会导致大鼠肾脏远端小管上皮细胞凋亡。我们通过研究噻嗪类利尿剂美特拉宗对肾脏和外周血αKlotho蛋白表达的影响,从一个新的切入点进一步明确αKlotho蛋白的主要来源。方法:将美特拉宗、呋塞米、空白对照分别通过腹腔内植入的渗透性微泵作用SD大鼠72小时(分3组,每组6只),处死后留取血、尿、肾脏组织标本。苏木素-伊红(HE)染色分析肾脏病理,免疫印迹及免疫组化法分析肾脏近端小管、远端小管标志性蛋白及αKlotho蛋白在肾脏的表达。同时用免疫沉淀法分析大鼠血清中αKlotho蛋白的表达。结果:相比于空白对照组和呋塞米组,美特拉宗组大鼠肾脏NCC、αKlotho、CB28蛋白的表达均明显减少,免疫沉淀结果提示美特拉宗处理后,大鼠外周血中αKlotho蛋白的表达也明显减少。肾脏病理提示美特拉宗组大鼠肾脏远端小管上皮细胞增殖明显,间质炎细胞浸润,部分小管塌陷。结论:在既往研究结论的基础上,我们进一步证明了肾脏远端小管来源的αKlotho蛋白是循环αKlotho蛋白的主要来源。并由此推测使用噻嗪类利尿剂导致的小管病理学改变有可能和肾脏本身以及循环中αKlotho蛋白表达减少相关。目的:急性肾损伤(AKI)向慢性肾脏病(CKD)进展的风险不断增加。αKlotho是一种细胞保护蛋白,其在AKI和CKD状态下均减少。但其表达水平和AKI向CKD进展之间的关系尚无相关报道。我们希望进一步探究αKlotho对AKI动物模型肾脏长期预后的影响,以及探讨αKlotho是否通过调节自噬活动参与缺血性/氧化应激性肾脏损伤的修复和细胞外基质的代谢。方法:我们建立了两种AKI动物模型:双侧缺血再灌注损伤(Bi-IRI)和单侧肾脏切除加对侧缺血再灌注损伤(Npx-IRI)。我们通过基因修饰、高磷饮食或衰老的方式改变系统αKlotho水平来研究两种AKI动物模型的长期预后,监测指标包括肌酐清除率(Clcr)、血浆磷(Ppi)、尿白蛋白/肌酐(ACR)、肾脏病理、促纤维化因子等。体外实验部分分别利用GFP-LC3和GFP-Col I质粒转染OKP细胞,并用H202、αKlotho、自噬诱导剂、自噬抑制剂等处理细胞,观察αKlotho对细胞自噬活动、氧化应激和I型胶原代谢的影响。结果:尽管两种AKI模型在最初都能实现肾功能的完全恢复,但它们最终都发展为CKD,表现为肌酐清除率下降、高磷血症和肾脏纤维化。与野生型(WT)小鼠相比,杂合子αKlotho缺陷小鼠更快地进展到CKD,而αKlotho转基因小鼠在AKI发生后则保持相对较好的肾功能。AKI之后给予高磷饮食会加重αKlotho缺乏,明显增加肾脏纤维化,并加速CKD进展。AKI发生后给予注射重组αKlotho蛋白可以加快肾脏功能的恢复,减轻肾脏纤维化。与WT小鼠相比,αKlotho缺陷和过表达分别对应细胞自噬水平的降低和升高以及肾脏功能的差异。在体外细胞培养实验中,我们还发现上调细胞自噬水平可以保护细胞免受氧化应激损伤,减少I型胶原的聚积。结论:αKlotho可以上调细胞自噬水平,缓解缺血再灌注损伤,改善肾脏纤维化,延缓AKI向CKD进展。目的:C反应蛋白(CRP)近年来被发现与AKI患者不良肾功能密切相关。但CRP在急性肾损伤(AKI)中究竟具有致病性或者仅仅是一个生物学标志物尚不明确。自噬缺陷被认为会加重肾脏缺血再灌注损伤(IRI)。我们试图探究CRP在AKI进程中是否抑制自噬。方法:我们将CRP过表达小鼠(Tg-CRP)分别与GFP-LC3转基因小鼠(LC3)和RFP-GFP-LC3转基因小鼠(RG-LC3)交配,获得PLC3小鼠和PRG-LC3小鼠,并通过IRI手术方式诱导AKI发生。比较不同基因型小鼠肾脏损伤程度及自噬相关指标的表达变化。结果:发现与LC3小鼠相比,PLC3在IRI手术之后表现出更严重的肾脏损伤。从LC3小鼠肾脏分离得到的肾脏小管细胞用于原代培养,另外将GFP-LC3质粒转染OKP细胞。培养液中加入CRP处理会增加两种类型细胞上清乳酸脱氢酶(LDH)的释放。免疫印迹实验结果显示PLC3小鼠与LC3小鼠相比在IRI手术后肾脏LC3 Ⅱ/Ⅰ比值降低而p62表达升高,均提示其肾脏自噬通量降低。同样,原代培养和OKP细胞在CRP和H202处理后与单纯H202处理相比,也出现LC3Ⅱ/Ⅰ比值降低而p62表达升高。免疫组化实验结果显示,PLC3小鼠在IRI手术后肾脏近端小管上皮细胞中的GFP-LC3 puncta数目比LC3小鼠少。CRP处理肾小管原代培养细胞和经GFP-LC3质粒转染的OKP细胞后,也表现为GFP-LC3 puncta数目较空白对照组减少。自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin)在体内实验中能够挽救受损的自噬水平。结论:我们提供了新的证据佐证CRP在AKI发生发展中不仅仅是单纯的生物学标志物,它可以通过下调自噬活动度加重缺血再灌注诱导的急性肾损伤。