骨肉瘤是青少年最常见的原发性恶性肿瘤,占原发恶性骨肿瘤的22.36%。目前对骨肉痈的治疗主要包括手术治疗和药物化疗。手术治疗结合辅助放化疗,患者五年生存率为60%-80%。大约80%的患者在诊断时已有远处转移,手术很难将原发灶与转移灶完全切除,预后差。由于化疗药物缺乏靶向性,而且,化疗药物使用剂量普遍偏大,往往对患者机体其它组织或器官正常细胞存在造成严重的毒副作用。尽管新辅助化疗的概念已经普遍被接受,但是其实施过程多以探索和摸索的方式进行,肿瘤组织对化疗药物的敏感性存在很大差异,导致大剂量化疗药物仅对部分患者有较好的治疗效果,对许多患者的身心造成巨大创伤。化疗药物靶向性差成为亟待解决的一个重要问题。靶向治疗通过定向结合和特异性杀灭肿瘤细胞,可避免大剂量静脉给药造成的全身性毒副作用,为骨肉瘤的治疗提供一种高效低毒的全新思路。寻找肿瘤组织靶向位点或者靶向载体成为重要课题,作为骨肉瘤靶向治疗的一项探索性研究,本实验试图通过筛选能够与人骨肉瘤细胞特异性结合的短肽,以短肽作为靶向载体,期待未来以短肽结合化疗约物的模式,将化疗药物定向导入骨肉瘤细胞,为实现骨肉瘤的靶向治疗奠定基础。寻找肿瘤特异性分子或受体显得尤为重要。为了获取能与上述靶点特异性结合的配体,必须具备有效的筛选手段。噬菌体展示技术的应用为实现此目的提供了一个全新有效的工具。噬菌体展现技术最早由Smith GP等建立。这项技术是20世纪90年代发展起来并得到广泛应用的新技术,基本原理是将编码外源蛋白或多肽的基因片段插入编码噬菌体外壳蛋白的基因中,使外源蛋白或多肽与噬菌体外壳蛋白融合表达在噬菌体表面,而不影响噬菌体的侵染和扩增能力。其主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内,把抗原分子的结合特性与噬菌体的可扩增性统一起来,成为一种高效的筛选体系。该技术最简单的淘选程序是将噬菌体展示肽库与包被有靶分的平板共同温育后,洗去未结合噬菌体,再洗脱特异性结合的噬菌体；洗脱出的噬菌体扩增后再进行下一轮的淘选。经3-4轮淘选后,特异性结合的噬菌体得以富集。该技术具有操作简单,高通量等特点,在生命科学许多领域中得到了极其广泛的应用,成为了寻找和开发新的特异性靶向肽的强有力工具。细胞作为一个复杂的生物体系,其表面分布着大量的信号分子,可反映细胞所处的功能状态与特殊功能。尽管理论上我们可将这些分子纯化作为靶标来筛选细胞的特异性结合肽,但由于细胞表面信号分子数量巨大,纯化这些分子相当困难,实际上难于完成。完整细胞筛选技术不需事先知道受体的有关信息,直接筛选某种特定状态下差异分子的表达,细胞表面受体的完整构象及生物学活性得到良好的保持,达到充分模拟白然条件下蛋白质分子间的相互作用的效果,有利于寻找到特异性结合于细胞表面的标志蛋白及某种细胞所特有的标志。但是,完整细胞膜表面抗原分布和对很低,抗体筛选存在一定难度,另外全细胞筛选仍有非特异性大、背景值高、洗涤过程中特异性配体损失等不利因素,难于获得针对某一抗原的单链抗体。为了解决这些问题,并且尽可能接近体内环境,我们在本研究中选用Giordano等于2001年新建立的用于全细胞差减筛选的“生物淘筛和对筛选出的反应配体的快速分析(BRASIL)"技术来筛选人骨肉瘤细胞MG63特异性结合肽。BRASIL技术的基本原理是将噬菌体肽库与差减细胞(本实验选用人胚肾细胞293T)孵育后,置于有机相上层进行离心,将留在上层水相中的未结合噬菌体进一步与人骨肉瘤细胞进行孵育,并再次置于有机相上层进行离心,与人骨肉瘤细胞结合的噬菌体通过离心力的作用进入有机相,这些结合的噬菌体再经过转染、扩增后测定滴度,进行下一轮筛选。与传统的噬菌体筛选方式相比,一步有机相离心分离技术利用特殊有机溶剂的配比(常用“邻苯二甲酸二丁酯：环已烷”的体积比为9：]),通过离心的方法使得噬菌体与细胞复合物沉淀下来,选择上层水相中未与差减细胞结合的噬菌体,将其与靶细胞孵育,再次离心,利用对数期大肠杆菌ER2738扩增目标噬菌体,测定滴度后调整噬菌体用量,进行下一轮筛选,如此反复进行四轮左右,便可获得与靶细胞结合性较好的噬菌体克隆。本方法与传统噬菌体筛选方法相比有着明显的优势,首先：本方法无需反复数轮的洗脱过程,因此大大减少细胞和配体的丢失；此外,还具有操作简便、快速等优点,每进行一轮筛选只需1天时间,大大节省了实验时间,提高了工作效率,利于实验条件及不确定因素的调控。本实验中我们选用“生物淘筛和对筛选出的反应配体的快速分析(BRASIL)"技术来筛选人骨肉瘤细胞MG63特异性结合肽。噬菌体环七肽展示肽库是将随机七肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pHI)上而构建成的一个组合文库。所展示的随机多肽受限于两侧各有一个半胱氨酸(Cys)。在非还原条件下,这两个半胱氨酸自发地形成一个二硫键,使展示的多肽环化。能够保持插入片段的稳定性。受限于二硫键环内的7肽库可用于识别抗原表位结构、D-氨基酸靶分子的镜像配基、开发以多肽为基础的治疗药物等。我们选用人骨肉瘤细胞MG63为靶细胞,以人胚肾细胞293T细胞为差减细胞,利用BRASIL技术进行体外筛选,首先将噬菌体肽库与293T细胞冰上震荡孵育后,转移至有机混合溶剂上层离心,将位于离心管上层水相的噬菌体与MG63细胞孵育,再次离心；用对数期大肠杆菌ER2738扩增与MG63结合的噬菌体,扩增后测定噬菌体滴度,调整扩增后噬菌体体积,用于第二轮筛选,重复进行,至获得噬菌体滴度相比上一轮噬菌体无明显富集效应；本实验中选用第4轮筛选产物铺板,随即挑取噬菌体克隆斑50个,经过PCR扩增目的片段后,DNA电泳鉴定挑取的噬菌体克隆中是否存在插入片段,选择所有存在插入片段的噬菌体克隆进行DNA测序。经过DNA电泳表明随即挑取的50个噬菌体克隆中,有24个存在插入片段,对所有含有插入片段的噬菌体克隆进行DNA测序结果表明,所有噬菌体克隆的测序结果均为TCGCTTACGAATTTGAGTAAG,翻译后序列为：SLTNLSK。我们应用酶联免疫法鉴定目标噬菌体(SLTNLSK)与人骨肉瘤细胞MG63的亲和力与靶向性,选用人胚肾细胞(293T)及人宫颈癌细胞(Hela细胞)作为对照细胞,结果表明,目标噬菌体对人骨肉瘤细胞MG63有较好的亲和力及靶向性。我们选用BALB/c裸鼠,采用原位种植的方法制备荷瘤裸鼠模型,尾静脉注射目标噬菌体SLTNLSK,体内循环十分钟后处死裸鼠,取肿瘤、肝脏、肾、心脏及肺组织,免疫组化的方法鉴定目标噬菌体与裸鼠模型不同组织间的亲和力及靶向性,结果表明,肿瘤组织内有大量噬菌体富集；心肌组织、肺组织内未见富集,肝脏组织内有少量富集。进一步证明目标噬菌体对肿瘤组织有较好的靶向性及亲和性。总之,本研究在靶分子未知的情况下,利用BRASIL技术,以人胚肾细胞为差减细胞,对人骨肉瘤细胞进行了4轮差减筛选,对经DNA电泳鉴定存在插入序列的噬菌体克隆本进行DNA测序,测序结果均为：SLTNLSK。表明噬菌体克隆有良好的富集效应。进一步通过应用酶联免疫法鉴定目标噬菌体与体外骨肉瘤细胞的靶向性与亲和力；制备荷瘤裸鼠模型,尾静脉注射噬菌体后取裸鼠重要组织,免疫组化结果进一步说明目标噬菌体对在体肿瘤组织有较好的靶向性及亲和性。在通过以上研究,我们得出以下几点结论：1.应用BRASIL技术成功筛选到人骨肉瘤细胞特异性结合肽,并经过四轮差减筛选,目标噬菌体有良好的富集效应。2.以第四轮筛选产物铺板,随即挑取50个噬菌体克隆,选择存在插入序列的噬菌体克隆测序,序列：SLTNLSK高度重复出现。3.细胞酶联免疫实验表明：噬菌体SLTNLSK对人骨肉瘤细胞有较好的靶向性及亲和力。4.成功复制人骨肉瘤荷瘤裸鼠模型,目标噬菌体尾静脉回输后,免疫组化实验进一步证实噬菌体SLTNLSK对活体骨肉瘤组织有较强的靶向性。