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随着多酶级联催化的广泛应用,多酶体系的共固定化也越来越受到关注。将多种酶在载体表面进行级联结合,充分地利用不同酶种的催化特性,提高中间产物的运转浓度,既能扩展酶催化的应用范围,又可以提升多酶体系的整体反应效率,在很大程度上克服了单酶反应体系单一催化的局限性。而酶定向固定化是将酶蛋白有序地结合到载体的特定位点,能最大限度地保持酶的天然构象,有助于保护酶催化的功能,具有非常重要的研究应用价值。葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD)和胆固醇氧化酶(Cholesterol oxidase,Ch Ox),均以黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavine adenine dinucleotide,FAD)为催化反应活性中心。GOD和Ch Ox分别可以催化葡萄糖(Glucose)和胆固醇(Cholesterol)生成对应产物和过氧化氢(H2O2)。H2O2不仅会对酶造成损伤,还作为中间产物发生累积从而抑制反应的持续进行。辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP),以血红素(Hemin)为活性中心,可消耗H2O2,促进反应正向进行。因此GOD和Ch Ox可以与HRP分别构建GOD-HRP以及Ch Ox-HRP多酶级联催化体系。这三种氧化还原酶,均存在辅基—即活性中心,因此可借助辅基-脱辅酶亲和作用构建定向共固定化多酶体系。该方法能实现高度的定向化,且不涉及对酶分子的修饰改性,对酶损伤较小,具有广泛的应用前景。本文采用辅基定向固定化的方法制备多酶级联催化体系:首先借助导电聚合物—聚苯胺(Polyaniline,PANI)在氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)表面构建了两臂不对称的“Y”型支架,分别将葡萄糖氧化酶(GOD)的辅基(黄素腺嘌呤二核苷酸,FAD)和辣根过氧化物酶(HRP)的辅基(血红素,Hemin)固定在功能化的载体上,然后将脱辅基的酶与之重组,完成定向共固定化的GOD-HRP和Ch Ox-HRP多酶催化体系的构建。研究发现,GOD-HRP多酶催化体系电化学活性比GOD单酶体系提高约3.6倍,底物反应的线性范围可达3~50m M;Ch Ox-HRP多酶催化体系电化学活性则比Ch Ox单酶体系提高约2.1倍,底物反应的线性范围可达3~80m M。定向共固定后的多酶体系热稳定性和耐酸碱性也有所增强。其中,GOD-HRP体系可在p H 6.5~7.0保有较高的催化活力,最佳反应温度为35℃;Ch Ox-HRP体系适用于p H 6.0~7.5环境,在35~45℃条件适用。通过改变导电高分子的长度,即调控多酶级联催化过程中电子传导的路线,电化学活性也会发生变化。由于载体材料中使用了GO和PANI,其表面基团、缺陷以及共轭结构都将影响电流的输送。因此,研究了不同还原程度载体材料对多酶催化的影响,测得电流值随还原程度增加而增大。