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猪繁殖与呼吸障碍综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种严重影响养猪业的疾病之一。PRRSV为单股、正链RNA病毒,其基因组全长约为15.1～15.5 kb,包含有11个开放阅读框(Open Reading Frame,ORFs),ORF1编码非结构蛋白Nsp1-Nsp12,其中Nsp12为目前研究较少的非结构蛋白,已有研究证实Nsp12是PRRSV复制所必须的,参与病毒RNA的合成,且Nsp12高度保守,通过研究PRRSV感染猪只后体内产生抗PRRSV Nsp12抗体的消长规律,可以进一步了解猪场PRRSV感染情况,对猪场PRRS防控具有重要意义。本课题利用原核表达系统,表达PRRSV非结构蛋白Nsp12,然后,利用表达纯化的Nsp12蛋白包被ELISA板,用于检测猪血清中抗蓝耳病的抗体,为评价PRRSV感染猪只后体内产生抗PRRSV Nsp12抗体的消长规律提供支持。课题实施的具体过程简述如下:1.PRRSV Nsp12的原核表达及纯化以提取的PRRSV的RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增编码PRRSV Nsp12蛋白的基因,扩增产物大小约为480bp;然后,通过酶切,连接将Nsp12基因序列克隆至原核表达载体p ET-32a中,得到p ET32-Nsp12重组质粒;随后,将重组质粒转化至大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)中,诱导后进行SDS-PAGE分析,表达产物大小约为40k Da(包括表达载体的标签蛋白和融合蛋白),反复摸索确定诱导Nsp12表达的最佳IPTG浓度和培养温度,然后利用Ni柱对表达的Nsp12进行亲和层析纯化,将纯化的Nsp12蛋白通过透析复性。2.猪血清中猪蓝耳病抗体检测利用纯化的重组Nsp12蛋白包被ELISA板,利用“棋盘法”摸索ELISA反应条件,对不同猪场采集的的92份血清样品(33份临床确诊病例)进行检测,结果显示,阳性32份((均为临床确诊病例样本)),阴性60份。本研究成功表达了PRRSV的Nsp12蛋白,且表达的Nsp12蛋白可用于检测猪血清中抗蓝耳病的抗体,为进一步研究评价抗PRRSV Nsp12抗体在PRRSV感染猪只中的消长规律提供了支持。